D．茚三酮法检测：取少量的树脂加入到1.5ml EP管中；分别加入检测试剂C溶液,混匀，100°C加热5min，树脂为透亮黄色表示反应完全
E.氨基酸FMOC保护基脱保护
1.加入剪切试剂
2.25度控温摇床上摇30min，减压抽滤除去剪切溶液。
3.依次用有机试剂洗两遍，每次约3ml（加二甲苯的洗得顺序相反）
F．重复C-E步骤，连接下一个氨基酸。
G．乙酰化 毕业论文http://www.youerw.com
1.所有氨基酸连接完成之后，加入8剪切试剂25度控温摇床上摇30min，减压抽滤除去剪切溶液
2.依次有机试剂洗两遍，每次约3ml
3.加入分散剂使树脂分散
4.每0.2mmol树脂中加入500ul(AcO)2O，再加入800ulDIEA，25度控温摇床震荡20min。
5.用DCM冲洗三遍，茚三酮检测（重复D 步过程）
6.检测完成后，依次用DCM,DMF,DCM,MeOH,DCM冲洗树脂
7.真空过夜除去有机溶剂，可以直接减压抽真空或者真空干燥，如图一。
H．反相高效液相色谱法进行粗肽分析（RP-HPLC）
反相色谱是基于蛋白质在极性流动相合非极性固定相见相互作用的差别而将蛋白质加以分离。
以（C4、C8、C18）烷基硅胶键合相为柱填料，以甲醇-水、乙腈-水或甲醇、乙腈与缓冲液构成的溶液为流动相，以紫外、荧光或电化学检测器为检测手段，这种色谱体系在多肽和蛋白质药物定量分析中应用广泛。
在实际操作中，我们以0.1%TFA乙腈和0.1%纯化水作为流动相，1%梯度来进行多肽的测定，如图二。
图一：固相多肽合成步骤简介
Fmoc---NH2—●
Fmoc脱保护
Fmoc--AA1—COOH + NH2—●
Fmoc--AA1—CONH2—●
哌啶/DMF Fmoc脱保护
AA2---AA26
重复步骤
NH2---AA1---CONH2—●
Fmoc-AA2-COOH 活化连接
茚三酮检测Fmoc—AA2—AA1-CONH2-●
检测
Fmoc—AA26AA25……AA2AA1—CONH2—●
Fmoc脱保护
NH2-AA26AA25……AA2AA1-CONH2-●
（ACO）2O 乙酰化
Ac—NH2—AA26……AA1—CONH2—●
TFA:TIS:H2O=90:5:5 切割及侧链脱保护
冰乙醚沉淀
Ac—AA26……AA1-CONH2 用50%乙腈/H2O溶解沉淀
真空冷冻干燥
分析HPLC
分析色谱检测
制备HPLC
制备纯化多肽
（图一）
图二：固相多肽合成步骤简介 （图二：粗肽分析）
（三）多肽合成技术的误区：
今天，多肽合成技术已经相当成熟，许多普通的单位都可以通过现成的多肽合成方案进行合成。对于新手来说，了解一定的多肽合成的原理，对于认识多肽合成的过程，排除合成中碰到的问题都是有好处的。简单来说，最基本的程序化的多肽合成工艺无非就是树脂溶胀、脱保护、偶联、再脱保护、再偶联……其他特殊的合成都是在这个基础上建立的。
对于多肽合成的新手来说，有几个误区：
误区一：合成时间越长越好。多肽合成的效率经过多年的摸索和优化，每一步的合成效率在短时间内都能达到99%以上，过长的反应时间对正面的反应产率提高非常有限，却大大增加了副反应发生的机率，所以过长的反应时间并不好。
误区二：氨基酸的侧链保护都一样。带有活泼侧链的氨基酸在合成中需要保护，根据侧链的不同，保护基也有不同的选择。选择适当的保护基可以有效地减少合成的难度。
误区三：万能的切肽试剂。大部分的多肽都可以用一套切肽试剂的组合从树脂上切下来，而对于有特殊侧链保护的氨基酸，往往需要调整这种组合，而对于没有侧链保护的多肽序列，是需要加入98%TFA和2%水的溶液就可以完成，要灵活运用切肽试剂的组合。
三：岗位操作常见问题及分析：今天，多肽合成技术已经相当成熟，许多普通的单位都可以通过现成的多肽合成方案进行合成。对于新手来说，了解一定的多肽合成的原理，对于认识多肽合成的过程，排除合成中碰到的问题都是有好处的。简单来说，最基本的程序化的多肽合成工艺无非就是树脂溶胀、脱保护、偶联、再脱保护、再偶联……其他特殊的合成都是在这个基础上建立的。
我在长春普莱药业实习工作的过程当中发现，书面上的理论知识与我们实际合成多肽的实验操作常常伴随着以下几点误区： 毕业论文http://www.youerw.com
1.合成时间越长越好。多肽合成的效率经过多年的摸索和优化，每一步的合成效率在短时间内都能达到99%以上，过长的反应时间对正面的反应产率提高非常有限，却大大增加了副反应发生的机率，所以过长的反应时间并不好。
2.氨基酸的侧链保护都一样。带有活泼侧链的氨基酸在合成中需要保护，根据侧链的不同，保护基也有不同的选择。选择适当的保护基可以有效地减少合成的难度。
3.万能的切肽试剂。大部分的多肽都可以用一套切肽试剂的组合从树脂上切下来，而对于有特殊侧链保护的氨基酸，往往需要调整这种组合，而对于没有侧链保护的多肽序列，是需要加入98%TFA和2%水的溶液就可以完成，要灵活运用切肽试剂的组合。
参考文献
［1］.李文楚,黄自然.昆虫抗菌肽及其基因工程、转基因动物.广州:广东科学技术出版社,1996.118-128.
［2］.郑青,鲍时翔,姚汝华,等.新型抗菌肽基因设计、合成及在酵母中表达Ⅰ———杂合抗菌肽基因的设计与合成[Ｊ].华南理工大学学报,1998,26(3):60-63.［3］.陈留存,王金星.生物工程进展,1999,19(5):55～59.
［4］.饶贤才,胡福泉,等.生命的化学,2001,21(5):357～359
致 谢感谢论文指导老师张丽红，是她给了我这个难得的机会让我能够在顺利完成此论文的同时也学到了课本以外的很多实践经验和知识，由衷地感谢他。
本实验是在陈育新教授的悉心指导下完成的，衷心感谢他在实验和生活中给予我的指导和帮助，衷心感谢他在我懈怠时给予我前进的力量。
感谢黄宜兵博士在工作中对我的支持与帮助。
感谢普莱药业的全体老师与同事为我创造了良好的实验条件和学习环境。