Zymography of laccases in Trametes gallica Fr.
Student majoring in biotechnology Ｗang Ｗei
Tutor Sun Xun
Abstract：The result showed that at least four laccse isoenzymes from Trametes gallica Fr.was abserved on the isoelectric focusing zymogram.
Key words：Trametes gallica, laccase, isoelectric focusing ，Zymogram
引言 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶[1]，最早是从日本的漆树汁中发现的，是人类最早发现的酶之一，但直到现在，人们对它的认识还不完整[2]。近年来，随着漆酶功能的逐步发现，有关漆酶的研究受到普遍的重视。由于在降解木质素方面的功能，使之在制浆造纸工业，特别是纸浆生物漂白领域得到深入的研究和开发[3,4]，在环保方面也有很大的潜力[5]，如漆酶可与有毒的酚类作用，使含苯氧基类的除草剂、石油化工废物的物质解去毒性等[6]。 随着应用的不断加深，漆酶的研究和开发越来越受到人们的关注[7]。本文仅就粗毛栓菌漆酶进行等电聚焦初步分析。
1 材料
1．1 菌种
菌种是由菏泽学院孙迅博士提供。经鉴定为粗毛栓菌Trametes gallica Fr.
1.2 PDA培养基
称取去皮马铃薯200g/L，加适量水煮沸20min，用纱布过滤得滤液，加入葡萄糖 20g，琼脂粉15g，补足水至1,000 mL，混匀，融化，分装，121℃灭菌20min。此培养基主要用于粗毛栓菌的保存。
2 方法
2.1 粗酶液的制备
菌种经麦草培养基培养30天后，将培养物取出，加去离子水，浸泡4h，然后用优层纱布过滤，取上清液。
2.2 等电聚焦酶谱分析
2.2.1仪器
DYY-8C型电泳仪（北京优一仪器厂）、圆盘电泳槽DYCZ-27B、电子天平、移液枪。
2.2.2试剂
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、两性电解质Ampholine、过硫酸铵、TEMED、H2SO4、NaOH、琼脂糖、愈创木酚。
2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶溶液配制
1、 丙烯酰胺贮液 29克丙烯酰胺和1克甲叉双丙烯酰胺溶于水，定溶至100mL，滤去不容物后存于棕色瓶。
2、聚丙烯酰胺凝胶配方（胶终浓度7.5%）取4.4mL丙烯酰胺贮液，加入1.1mLAmpholine（40%，pH 3-10），12mLdH2O，17.6uLTEMED（10%），17.6uL过硫酸铵（10%），粗酶液80uL。
2.2.4装管原文请找腾讯752018766优.文-论'文;网http://www.youerw.com
先用0.7%的琼脂糖凝胶（使用电极液0.4M NaOH溶液配制）将洁净的玻璃管封底约0.5厘米，将配好的丙烯酰胺（含两性载体）胶液加入玻璃管内，液面加至离管口约2mm处，用移液枪轻轻加入少许水。于20℃，聚合30min。
2.2.5装槽
封水端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管高度记录管号，上槽加入500mL 0.4M H2SO4,下槽加入500mL 0.4M NaOH，用注射器吸去管口气泡。
2.2.6电泳
开启电泳仪，恒压160V聚焦2-3小时，至电流趋近于零不再降低时停止电泳。
2.2.7剥胶及显色
按常规方法剥胶【8】，将胶条浸于0.2mmoL/L愈创木酚中（含2mg/L CuSO4•5H2O）
2.2.8拍照
待酶与底物反应一段时间（约2-3小时），待胶条上呈现明显的棕色条带时进行拍照。
3 结果与讨论
1、结果，本研究共观察到4条显色带其中两条显色较强，见上图。
2、凝胶的浓度要适宜，浓度太大会影响蛋白样品的迁移，浓度太小凝胶不易聚合，研究曾采用5%凝胶，发现凝胶难以聚合，而且影响剥胶。上图结果用的是7.5%的凝胶。
3、底物中加入铜离子，是为了加快显色反应，因为漆酶中有铜离子，与底物反应有关。