粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR扩增
一、立题依据(国内外研究进展或选题背景、研究意义等)
木聚糖酶广泛应用于造纸、食品、饲料添加等方面,已受到广泛的关注。近年来, 木聚糖酶成为制浆造纸工业应用木聚糖酶最多的行业, 这方面每年都有大量的文献报道。迄今为止, 木聚糖酶在食品行业中的应用虽已渐渐深入, 但其发展空间仍相当广阔。有望在生产实践中应用的木聚糖酶具备优良性质,如高比活性的酶可降低应用成本,抗逆性强的酶具有更好的贮存和应用稳定性等。因此有必要利用现代基因工程技术,有目的地选育、改良木聚糖酶,以满原文请找腾讯752018766优~文-论'文.网http://www.youerw.com 足实际生产的需要,从而发挥其应用潜力。
PCR技术即聚合酶链反应，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。在分子生物学基础研究上，PCR被广泛地用于基因克隆和制造突变。RT-PCR技术现已成为国内外研究的热点，在基础研究方面不仅可以扩增目的基因，还可对基因组测序，用反向PCR方法填补拼接时留下的“缺口”（gap）。RT-PCR技术不仅可用于RNA分析，还可用于检测活动性的隐性病毒感染等。本课题主要是在对粗毛栓菌木聚糖酶的分布、来源、结构、性质及其功能等各方面有了深入了解的基础上，通过RT-PCR技术，对木聚糖酶的cDNA进行扩增。
二、研究的主要内容及预期目标
主要内容：培养粗毛栓菌，提取RNA， RT-PCR反应。
预期目标：通过PCR反应获得木聚糖酶的cDNA
三、研究方案（思路）
以半纤文素作碳源，用高碳高氮培养基培养粗毛栓菌, 振荡培养9-12天后收集菌丝体，提取总RNA，然后进行RT-PCRF反应。
四、论文进度安排
1、2010.4.27-5.20菌种培养。
2、2010.5.20总RNA的提取。
3、2010.5.20总RNA浓度与纯度的测定。
4、2010.5.21总RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。
5、2010.5.22逆转录及PCR。
6、2010.5.22 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。
生物科学专业学生 伍豪
指导教师 孙迅
摘要 本实验以粗毛栓菌作为出发菌，进行了木聚糖酶cDNA的PCR扩增。以木聚糖为碳源，用高碳低氮培养基, 培养7d，收集菌丝体，提取总RNA，做RT-PCR。结果表明，PCR扩增出两条亮度较弱的DNA带。
关键词 粗毛栓菌，木聚糖酶cDNA，RT-PCR扩增
PCR Amplification of Xylanase cDNA in Trametesec gallica
Student majoring in Biology Wu Hao
Tutor Sun Xun
Abstract Total RNA was extracted from Trametes gallica cultivated for 7 days in high C -low N medium. The result showed that two cDNA fragments was amplified by RT-PCR.
Key words Trametes gallica, Xylanase cDNA, RT-PCR
引言
粗毛栓菌（Trametes gallica）是一种白腐担子菌，在我国分布广泛，是杨木的一种主要生物降解者。已有研究表明，该菌产木聚糖酶(Xylanse)能力较高[1]。木聚糖是一种多聚五碳糖，为半纤文素的主要成分之一。木聚糖酶是一类降解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键的酶系，主要包括内切β- 1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，通过水解木糖分子β-1，4-糖苷键，将木聚糖水解为木寡糖和木二糖等低木聚糖，及少量木糖和阿拉伯糖。用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆可减少后续漂白处理化学剂的用量。由于木聚糖可以用于纸浆的预漂白、饲料添加剂提高饲料的能量值及畜禽对饲料的吸收率、增殖肠道内的双歧杆菌，用于食品改良剂和酿酒等方面的潜在应用价值，越来越多的研究者对木聚糖酶的分子结构、性质、最佳作用条件及其在各领域的应用进行了广泛而深入的研究。
PCR技术即聚合酶链反应，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性原文请找腾讯752018766优~文-论'文.网http://www.youerw.com 好、易自动化等突出优点。在分子生物学基础研究上，PCR被广泛地用于基因克隆和制造突变。RT-PCR技术现已成为国内外研究的热点，在基础研究方面不仅可以扩增目的基因，还可对基因组测序，用反向PCR方法填补拼接时留下的“缺口”（gap）。 RT-PCR技术不仅可用于RNA分析，还可用于检测活动性的隐性病毒感染等。本课题主要是在对粗毛栓菌木聚糖酶的分布、来源、结构、性质及其功能等各方面有了深入了解的基础上，通过RT-PCR技术，对木聚糖酶的cDNA进行扩增。
1 实验材料与方法
1.1 菌株及培养方式
白腐担子菌粗毛栓菌系导师孙迅于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallicaFr[4] 图1.1[5]。1827