1.2 使用仪器和试剂
1.2.1 使用仪器
高压蒸汽灭菌锅，HPS-250生化培养箱，5417-R型Eppendorf 离心机（德国），电泳仪DYY–8C型（北京优一仪器厂），DYY-III-31A型水平电泳槽(北京市优一仪器厂)，TU-1810紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司），TP600型梯度PCR仪（日本Takara公司），FR-200紫外与可见分析装置（上海复日科技有限公司）。
1.2.2 所用试剂
半纤文素，酵母粉，微量元素，氯仿-苯酚混合物，异丙醇, 乙酸铵， 75%冰冷乙醇， 37%甲醛，甲酰胺，溴乙锭（0.5g/mL）， (NH4)2SO4，Mg2SO4•7H2O，10×PBS（Na2HPO4 11.5g， KH2PO4 2g， NaCl 80g， KCl 2g溶于1L灭菌去离子水中，1×PBS的pH为7.4），DEPC水（二乙基焦碳酸盐, diethyl pyrocarbonate）, 5×甲醛胶缓冲液{ 0.1mol / L MOPS [ 3—(morpholino) propanesulfonic acid ] pH7.0；40 mmol ∕ L 乙酸钠；5mmol ∕ L EDTA , pH8.0}，细胞裂解液{内含CBS(柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/ β-巯基乙醇)}，RNA抽提用的Takara试剂盒（日本Takara公司），EDTA；琼脂糖（英国）；反转录试剂盒（日本Takara公司）；PCR扩增试剂盒（日本Takara公司）；TBE缓冲液，250bp-DNA-Ladder-Marker（日本Takara公司）等。
1.3 准备实验
对有关器皿及试剂的处理，按照有关文献所述进行[6]。
1.4 总RNA的提取
总RNA的提取 使用Chomczynski和Sacchi[10]所提出的酸酚抽提法并略作改动。将培养液中的菌丝体转移至三层纱布上，并用上述无菌预冷PBS缓冲液反复冲洗。取出菌丝体，置于无菌的多层 “新华1号”滤纸之间，吸干多余的液体。用灭菌牙签迅速将菌丝体(大约0.4g)转移至已经DEPC处理过的20 mL玻璃研磨器中，加入6 mL预冷的RNA抽提裂解变性液{25g异硫酸氰胍，溶于33mLCBS缓冲液}，研磨，直至研磨液呈均匀的浆液状。加入0.5 mL 2 mol/L 的HAc-NaAc（pH 4.0）缓冲液，混合均匀。将研磨液转移至10只用DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的（约0.6mL）酚-氯仿混合液（酚∶氯仿∶异戊醇 = 25∶24∶1），混匀，强力振荡（涡旋）20 sec，然后静置冰浴10 min，离心（10000rpm，4℃，15min），取出上层水相至另外5只经DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的氯仿，离心（10000rpm，4℃，10-15min），取出上层水相至另外2只经DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的冰冷的异丙醇，上下反转几次（混匀），-20℃冷冻10-20min，离心（10000rpm，4℃，15min），弃去上清夜，再向每管中分别加入0.5mL 75%的乙醇，离心（10000rpm，4℃，15min），弃净乙醇，室温下开盖静置5-10min，加100µL DEPC水，并于-20℃下保存，备用。
1.5 RNA浓度和纯度的测定
1.5.1 RNA浓度测定
取25l上述总RNA的提取液和2500l去离子水，放入石英比色皿中，混匀，分别在260nm和280nm波长下，用分光光度计测量其光吸收值（即A260 和A 280），通过计算A260 和A 280的比值测其纯度；根据其光密度值OD260的大小和RNA样品浓度计算公式计算总RNA的浓度， RNA样品浓度计算公式如下：总RNA样品的浓度（g/l）=OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000
1.5.2 RNA纯度测定
在分光光度计中，260nm波长下，1 OD值的光密度相当于单链RNA浓度的40g/ml，所以RNA样品浓度计算公式为：总RNA样品的浓度（g/l）=OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000. 菌丝体总RNA制备物的OD260 为0.046，所以总RNA原文请找腾讯752018766优~文-论'文.网http://www.youerw.com 浓度为：OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000=0.05 ×（2500/25）×40/1000=0.184g/l。
在分光光度计中，测得OD260，OD280值分别为0.046和0.032, 所以OD260 /OD280的比值为1.44，说明总RNA纯度较低。
1.6 总RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行检测[6]。称取0.4 g琼脂糖于24.8 mL灭菌水中，加热融化，冷却至50℃后加入8mL 5×甲醛胶缓冲液{0.1 mol/L MOPS [3-（morpholino） propanesulfonic acid], pH 7.0；40 mmol/L乙酸钠；5 mmol/L EDTA，pH 8.0}和7.2 mL 37%甲醛，混匀后，待不烫时倒入胶槽中，冷却，凝固。取9μL RNA样品与4μL 5×甲醛胶电泳缓冲液、7μL 37%甲醛和20μL 10mol/L的尿素混合，65℃，保温15 min，于冰浴中速冷，加入4.5μL 10×上样缓冲液，混匀，立即将样品上样于已预电泳5 min的加样孔中，在1×甲醛胶电泳缓冲液中恒压（3-4 V/cm）电泳（本实验实际用95V），待溴酚蓝染料到达凝胶底部约1/4处时，停止电泳，将凝胶浸入含溴乙锭（0.5μg/mL）的0.1 mol/L乙酸铵溶液中染色30 min。最后用FR-200紫外与可见分析装置显像，并拍照。