粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR+扩增cDNA片段 第3页

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RT-PCR
2.5.1 RT-PCR过程
利用日本Takara公司生产的反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒进行逆转录。在0.5mL EP管中加入10xOne Stet PR-PCR Buffer  10L，One Step Enhancer Solution  2L，dNTP Mixture (10meach)  4L，RNase Inhibitor (40U/L) 2 L，Prime ScriptTM RTase (for one Step)  1L，TaKaKa EX TaqTMHS (5U/ L)  2 L，上游特异引物（20µM）2 L，下游特异引物（20µM）2 L，试验样品20L，无RNase水至100L，混匀后，于干式恒温器中50℃保温30min，冰上速冷，再用70℃保温5min。将混合物平均分装到4个0.5mlEP管中，并编号①~④。  将4个0.5mLEP管，放入梯度PCR扩增仪中，温度分别是49℃、52℃、55℃、58℃进行PCR反应，条件如下：94℃ 5min（预变性）；94℃ 30sec，退火30sec，72℃ 1 min，（30个循环）；72℃ 3min。
2.5.2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
PCR反应结束后，称取0.5g琼脂糖于50 mL 0.5 × TAE缓冲液中，加热融化，待不汤时倒入胶槽中，冷却，凝固。分别向①~④EP管（每管22.5μL）中的加入2.5 μL 10x上样缓冲液，混匀，立即将样品上样于已预电泳5 min的加样孔中，每个样孔加样10μL，DNA marker样10μL同时上样于样品道旁边，另一边加9μL电泳缓冲液与1μL上样缓冲液的混合物，恒压（110V）电泳。待染料到达凝胶底部约1/4处时，停止电泳，将凝胶浸入溴乙锭（0.5 μg/mL）溶液中染色30 min，然后用去离子水漂洗3min-5min。最后用FR-200紫外与可见分析装置显像。                                                      

3  结果与分析
3.1  总RNA电泳结果
mRNA的质量（分子的完整性和纯度）在随后的反转录反应中，是决定能否获得全长cDNA的关键因素之一，在细胞内，RNA主要由以下几类分子组成：rRNA（占RNA总量的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10%～15%）、mRNA（占1%～5%）。根据沉降系数，真菌的rRNA一般可以分为25S（在高等动植物，一般为28S）、18S和5.8S等几类。由于rRNA在总RNA中含量多而种类少，所以根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳或离子交换层析就可以将它们分离[5]。尽管mRNA分子种类繁多，但是其含量少，分子量大小也很不均一原文请找腾讯752018766优,文-论'文.网http://www.youerw.com 在电泳图谱上，往往呈微弱的弥散形分布。对新制备的总RNA中mRNA质量的检测，通常是依赖凝胶电泳技术，通过对rRNA质量的判断而确定的。高质量的总RNA制备物的电泳图谱应当是，28S rRNA和18S rRNA的带形整齐，且无脱尾或弥散现象；有时，28S rRNA带的亮度可达到18S rRNA的2倍。在总RNA的制备过程中，如果由于操作不当或由于RNase的污染而造成28S rRNA和18S rRNA部分降解，那么，在电泳图谱上，它们的带形就会出现严重拖尾或弥散现象，甚至不成带形，一旦出现这种情况，就说明mRNA的质量也已经没有保证了，即不能用于RT-PCR、Northern印迹和分子杂交等研究工作了。因为在总RNA中，mRNA应当是伴随着28S rRNA和18S rRNA的降解而降解的，尤其是由于RNase引起的降解作用更是如此[4]。
电泳结果不明显，没有图像，只看到空白的胶。
3.2 总RNA纯度与浓度的检测
    在756分光光度计中，260nm波长下，1 OD值的光密度相当于单链RNA浓度的40g/mL[5]，所以RNA样品浓度计算公式为：总RNA样品的浓度（g/L）[5]=OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000 。菌丝体总RNA制备物的OD260 为0.046，所以总RNA浓度为：OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000=0.046 ×（2500/25）×40/1000 = 0.184g/L。测得OD260、OD280值分别为0.046和0.032, 所以OD260 /OD280的比值为1.44，说明总RNA纯度不高，可能含有较多的蛋白质。
3.3  木聚糖酶cDNA的PCR扩增及检测
木聚糖酶cDNA的PT-PCR效果比较明显，两条带大约为1000bp和1200bp

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