粗毛栓菌木质素过氧化物酶的分离与纯化 第3页
样品的制备
1.4.1粗酶液的制备
过滤 培养60天后，将全部扩大培养基取出用6层纱布过滤，弃滤渣；取上清夜。
盐析 首先在粗酶液中添加固体（NH4）2SO4粉末至30%饱和度（16.4 g∕100mL），盐析过夜。
离心 离心（4℃、6000 rpm) 15 min，取上清液。
盐析 在上清液1350 mL中添加固体（NH4）2SO4粉末至75%饱和度（28.5g∕100mL）盐析过夜。
离心 离心（4℃、7500 rpm) 20 min，弃去上清液 ，取沉淀。
透析 将沉淀转移到透析袋内（截留量12-14KD），对预冷的蒸馏水透析。每隔2-3h换一次水，于4℃下透析3-4次。
1.4.2 酶的超滤浓缩
培养60d后，向培养物中按1：7的加入无菌dH2O，用接种铲将培养物分散，于4℃振荡浸提4h；用3层纱布过滤，弃滤渣，得上清液，我们取出100ml以备测酶的总活力；取上清夜，将上清液转移到超滤装置进行超滤浓缩，得液浓缩大约800ml, 取出一部分对其进行酶活力的测定，剩余的加入硫酸铵进行盐析。
1.5 硫酸铵沉淀
将得到的浓缩液先添加硫酸铵至30﹪饱和度，4℃进行盐析，每隔两小时换一次水，盐析一天，离心（4℃，7500rpm,20min）,弃沉淀，得上清液。将上清液的硫酸铵的饱和度调至75％，重复以上盐析过程，离心（4℃，7500rpm,20min），得沉淀。将所得的沉淀加少量的4℃的预冷水收集起来，透析，冷藏备用。
1.6 离子交换层析
装柱 首先用阴离子交换剂Sepharose-Q Fast Flow装制成一根1.6×20 cm柱，连接核酸-蛋白紫外检测仪和自动部分收集器。
平衡 上样前预先用20 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.5）平衡交换柱。
上样 用蠕动泵将经透析的原酶液以1 mL/min的速度加于交换柱上。
洗脱 上样完毕后，用同样的缓冲液洗柱，待OD280光吸收峰值回到基线后，用20 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.5）和由此溶液配制的1 mol/L NaCl对离子交换柱进行梯度洗脱（梯度溶液由梯度混合器获得，NaCl溶液的浓度由低到高），洗脱速度为1.5 mL/min，用自动部分收集器收集流出液，每3 min收集1管。
测定酶活 测定流出液的酶活性，合并具有同样酶活性的流出液，用（NH4）2SO4盐析（80%饱和度）各类流出液，离心（4℃，10,000g，20 min）收集沉淀。
透析 用少量蒸馏水溶解沉淀，再对蒸馏水进行透析。
浓缩 透析液经聚乙二醇（平均分子量＞17,000）浓缩后，作为下一步进行分子筛层析的样品.
2 结果
2.1 酶活测定原文请找腾讯752018766优,文-论'文.网
http://www.youerw.com木质素过氧化物酶（Lignin peroxidases，LiPs, EC 1.11.1.14）活力的测定：按Tien和Kirk所描述的方法进行[10]。此类酶活力由测定其氧化藜芦醇为藜芦醛（ε310 ＝ 9,300 M-1cm-1）的最初反应速度确定。反应混合液含有25 mmol/L酒石酸缓冲液（pH 3.0）、 2.5 mmol/L藜芦醇、0.5 mmol/L H2O2和适量酶液，于25℃测定酶反应前3 min内在310nm吸光值的增加。酶促反应由加入H2O2后而启动。定义每分钟使1μmol/L藜芦醇氧化所需的酶量为1个活力单位（U）[12]。
木质素过氧化物酶酶活力计算公式如下：
U/L ＝ n × ΔA × 106 / 9,300 × 3
其中，n为酶液稀释倍数，ΔA为3 min内反应液在310nm处吸光值的变化值。
对浸提的酶液进行了酶活测定。说明此中培养基所产的木质素过氧化物酶是具有酶活的。 将透析液上样于Q-Sepharose F. F.层析柱，获得具有木质素过氧化物酶活性的组分。
管号 测得的数值Abs（3min） 酶活（U/L）
80 0.001 U=7.168
90 0.026 U=186.380
100 0.201 U=1440.860
110 0.049 U=351.254
120 0.015 U=107.527
130 0.004 U=128.674
140 0.001 U=7.168
表1 纯化的粗毛栓菌LiP在紫外-可见分光光度计测的的结果（λ=310；20℃）
注：粗毛栓菌LiP活力计算公式: U/L=n×ΔA×106/9,300×3 (ΔA代表吸光值;n代表稀释倍数;n=200)；由图示知酶活性主要集中在80-140管之间
2.2洗脱曲线
以洗脱体积（mL）为横坐标，以每3min求得的酶活力值（U/L）做纵坐标，绘制洗脱曲线如图1.
3 讨论
粗酶液经过盐析、透析及离子交换层析等一系列操作步骤后获得了具有木质素过氧化物酶活性的组分，但量很少，酶活较低，达不到快速高效降解制浆工业废水的要求，下一步做实验时应进一步探索粗毛栓菌产木质素过氧化物酶的条件，使其产更多的木质素过氧化物酶。
另外，单独使用一种纯化方法纯化的效果不是很理想。因此，以后的实验中应该考虑组合多种方法，协同进行分离和纯化工作。
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