1 前言
1.1研究背景
肺癌对人类健康的威胁日益严重，世界卫生组织（WHO）2004年发表《世界癌症报告》指出，现全球发病率最高的癌症是肺癌，每年新增患者120万人，其中非小细胞肺癌（NSCLC）人数占肺癌总数的约80％。由于大多数肺癌患者在确诊时已经失去了手术机会，放化疗又会产生明显的毒副作用及治疗抗性，导致因肺癌死亡的人数占所有癌症死亡人数的17．8％，居各类恶性肿瘤死亡首位，其死亡率比排位第二的胃癌高7．4％。虽然近年来化疗、放疗有了长足的进步，但是肺癌患者的长期生存率并未得到明显的提高，有远处转移的 NSCLC 的5年生存率更不足5％。因此急切需要新的有效的治疗方法和措施；同时，尽管延长生存时间一直是晚期 NSCLC 治疗的主要目的，而缓解患者的临床症状、提高患者生存质量同样是肺癌治疗的重要目标[1,2]。
近年来，随着生物及分子靶向治疗的深入研究和各国学者对肺癌治疗的重视，肺癌分子靶向治疗的研究得到了快速的进展。肺癌分子靶向治疗是指在肺癌分子生物学的基础上，将与肺癌发生、发展、预后等密切相关的特异分子作为靶点，利用靶分子特异制剂或药物进行治疗的方法。这种以肺癌细胞特异分子为靶点的治疗包括细胞生长因子受体抑制剂、血管生成抑制剂及信号传导抑制剂等药物，相对于手术、放疗、化疗三大传统治疗手段来说，它们具有独特的优势，即为非细胞毒性、以调节和稳定细胞为主、无明显的毒副作用、耐受性较好等[3,4]。
1.2 p53 基因原文请+QQ752018766优.文^论,文'网
在这些分子靶点中，p53 基因的结构、功能以及作用机制是研究较为透彻的一个抑癌基因。人类p53 基因位于17号染色体的短臂，全长16-20 kb 10个内含子和11个外显子，其中第1个外显子不编码，其编码的蛋白质是由393个氨基酸(aa) 组成的与细胞分裂周期相关的核磷酸蛋白质 Mr 53 000 称为 p53 蛋白。
p53 蛋白的AA序列中分五个部分：
1） N-末端的转录活化区(1-42 aa) 能与一系列的蛋白结构(如 MDM2 TBP TAFs)结合而调节 p53 的转录功能。
2） 信号区(64-92 aa) 富含脯氨酸 有 5个脯 -X-X- 脯重复顺序，此区不是转录活化所必须的 但对诱导细胞调亡是必需的。
3） DNA 结合区(102-292 aa) 识别顺序专一的 DNA 序列。
4） 四聚体化区(324-355 aa) 此区能抑制癌细胞的生长。
5） C- 末端的非专一 DNA 结合区(370-393 aa) 能与非特异性的 DNA 序列结合。
野生型 p53 是细胞生长的监控器，它的主要功能为：①调节细胞生长周期，使细胞停滞在 Gl 期；②参与DNA损伤修复；③参与诱导细胞凋亡。突变型 p53 则不具备以上的功能。野生型 p53 蛋白极不稳定，半衰期很短，而突变型 p53 则很稳定，可以在核内积聚，因此，可以用免疫组织化学方法检测到它的存在。突变型 p53 的检测可以很好反映 p53 基因突变情况[5,7]。
p53 正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变，通过肿瘤中大量的突变体分析，证实大部分突变是位于4个突变热点之一的错义突变。这4个突变热点是氨基酸129-146、171-179、234-260、270-287，正对应于 p53 基因进化最保守区段，体外实验证实突变体失去特异位点的结合能力，此外，突变体还可以改变 p53 的球形构象。例如，一些突变体可与热体克蛋白结合，一些突变引起213-217段的暴露。另外，一些则引起酸性激活结构域的改变，这些突变提示 p53 的微小改变可引起远离突变位点区段甚至整个蛋白构象的改变。构象的改变不仅影响突变体，还影响野生型的功能[7]。
目 录
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ABSTRACT II
1前言 1
1.1研究背景 1
1.2 p53 基因 1
1.3突变检测的方法 2
1.4研究趋势及其展望 5
2材料与方法 6
2.1实验材料 6
2.1.1实验样品 6
2.1.2菌种和质粒 6
2.1.3实验试剂 6
2.1.4实验仪器 7
2.2实验方法 8
2.2.1实验流程示意图 8
2.2.2基因组DNA的提取 8
2.2.3引物的设计 10
2.2.4突变热点所在外显子的 PCR 扩增 12
2.2.5野生型质粒的点突变 14
2.2.6 ARMS-PCR模型的建立与优化 15
2.2.7 ARMS-PCR对样品的检测 16
3结果与分析 18
3.1实验结果与分析 18
3.1.1基因组DNA电泳图 18
3.1.2外显子扩增及菌液PCR鉴定电泳图 18
3.1.3质粒提取电泳图 19
3.1.4点突变测序结果分析图 19
3.1.5 ARMS电泳图 21
3.1.6样品ARMS-PCR检测结果 24
3.2小结 26
4总结 28
参考文献 29
谢辞 31 ,2075