经济高效的人足月胎盘滋养细胞培养方法
胎盘是妊娠期存在的特殊器官，是母体与胎儿之间物质交换的场所，是文持胎儿在宫内营养、发育的重要器官[1].胎盘细胞成分复杂，其中滋养细胞在胚胎植入、妊娠文持中扮演着重要角色，其功能调节失常与多种妊娠相关疾病的发生发展密切相关。目前滋养细胞的体外模型主要有原代滋养细胞和滋养细胞系两大类，滋养细胞系操作方便，但是任何一种滋养细胞系都无法完全替代原代滋养细胞。
课题组前期[2-4]已经成功培养出早孕期绒毛滋养细胞，同时对趋化因子在早孕期母胎界面的免疫调节机制做了一系列的研究。但是早孕期绒毛中提取的细胞数量十分有限，若进行分组实验则会受到细胞数量的限制。近年来有研究[5]认为足月胎盘中富含滋养细胞，并且这个时期的细胞对研究滋养细胞相关的病理妊娠有很大的价值。本研究在前期研究的基础上，拟建立一种经济、高效的人足月胎盘滋养细胞培养方法，为日后研究滋养细胞及相关疾病提供重要的实验基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1胎盘组织选取武汉大学中南医院妇产科因社会因素行剖宫产的健康产妇。产妇年龄为20-35岁，孕周为37-40周，均为单胎妊娠，排除高血压、心脏病及传染病史。术中用无菌手术剪剪取脐带周边面积为5cm×5cm大小的胎盘组织，立即放入含双抗（青霉素0.1g/L,链霉素0.1g/L）无菌PBS中于2h内送回实验室，4℃保存。标本收集经武汉大学中南医院医学伦理委员会批准及孕妇本人知情同意。
1.1.2主要试剂及仪器DMEM/F-12（美国Hy-clone），胰蛋白酶粉、青霉素-链霉素双抗溶液、DNA酶Ⅰ型DN25、细胞外基质胶（extracellular matrix,ECM胶）、CCK-8试剂盒（美国Sigma公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司），Percoll细胞分离液（美国phamacia公司），小鼠抗人角蛋白（cytokeratin,CK）-7单克隆抗体、兔抗人波形蛋白（Vimentin）多克隆抗体、免疫组化试剂盒、免疫组化DAB试剂盒（福州迈新生 物 技 术 开 发 公 司）；二 氧 化 碳 培 养 箱 （美 国SHELLAB），倒置显微镜（日本Olympus）；恒温摇床、离心机（德国Eppendorf）、酶标仪、无菌超净台。
1.2方法
1.2.1原代培养取约40g胎盘组织，在无菌操作台中用无菌手术剪将胎盘组织分离除去大血管、结缔组织，用无菌PBS反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色。将组织尽量剪碎至1-3mm3,并尽可能去除肉眼可见的小血管和纤文连接成分。将剪碎的组织加入终浓度为0.25%胰酶和0.2mg/ml DNAseⅠ组成消化液，分3次消化，消化液总体积分别为150,100,75ml.分别在恒温摇床中37 ℃、120r/min消化20min.前两次的消化液经100目网筛过滤后倒除，剩余组织再进行第3次消化，血清终止消化、网筛过滤后收集消化液，4℃离心1 500r/min,15min,离心后弃上清以3ml DMEM/F-12重悬细胞。
1.2.2细胞纯化---不连续Percoll密度梯度分离在15ml无菌离心管中按浓度从大到小逐层铺入70%,50%,30%,10% 4个 密 度 的Percoll分 离液[6],每个密度铺3ml.然后将3ml细胞悬液缓慢加于Percoll分离液上层，4 ℃水平离心机下2 000r/min离心20min.用吸管小心吸取30%-50%之间云雾状的细胞层 （滋养细胞），放入一支无菌离心管里，用约4ml DMEM重悬细胞，室温下1 000r/min离心5min.弃上清后的细胞沉淀，用含15%胎牛血清的DMEM/F-12重悬细胞，将细胞悬液浓度调整至1×106ml,种于预先置有盖玻片以及铺好ECM胶的6孔板内，5%CO2、37℃的温箱里培养。
1.2.3细胞鉴定细胞培养24h后取出6孔板中细胞爬片，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定15min.固定细胞经0.1%TritonX-100增加细胞膜通透性后，按照免疫组化试剂盒进行操作。封闭液室温孵育15min后，PBS洗3遍，分别加入CK-7、Vimen-tin单克隆抗体，PBS代替一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜。次日依次加入生物素标记二抗、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶反应试剂，DAB避光显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察拍照计算纯度。
1.2.4 CCK-8增殖实验分离得到的原代滋养细胞以2×105细胞/孔种植于96孔板，培养24,48,72,96,120h,每孔加入CCK-8液10μl,37℃继续孵育2h后，终止培养，选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值。
2 结果
2.1免疫细胞化学鉴定足月胎盘滋养细胞
细胞爬片染色结果显示，CK-7标记细胞胞质和胞膜可见明显的棕黄色染色，阳性表达的细胞大于90%（图1A）；波形蛋白染色与阴性对照组均表达阴性（图1B、1C）.
2.2体外培养足月胎盘滋养细胞生长的动态观察
每次取材组织量约30-40g,可获得细胞数量大于107个细胞。新鲜分离的细胞为均一的圆形单核细胞，核大突出，胞质丰富（图2A）。培养3h后开始贴壁（图2B）,12h后基本全部贴壁，细胞呈胖三角形或不规则多角形和圆形，24h后可见细胞开始融合成具有多个核的合体滋养细胞，并随着时间推移逐渐融合成片生长（图2C）。细胞不能传代生长。
2.3滋养细胞体外增殖活力
利用CCK-8增殖实验检测原代培养滋养细胞体外增殖能力，从生长曲线上看细胞在体外96h可达小高峰，但不能成倍增殖，表明细胞体外增殖能力低下（图3）.【1】
3 讨论
滋养细胞是构成胎盘的主要细胞，在文持妊娠和抵御 病 原 微 生 物 的 宫 内 传 播 中 扮 演 着 重 要 角色[7].流产、早产、妊娠期高血压疾病、胎儿生长受限等多种产科疾病都可能与滋养细胞的功能异常相关[8-10],因此建立滋养细胞体外培养模型是滋养细胞相关的病理妊娠机制研究的实验基础，具有十分重要的意义。晚孕期胎盘绒毛组织中细胞成分复杂，滋养细胞的纯化是此研究的关键。胎盘滋养细胞的分离方案中，以1986年Kliman等[11]建立的Per-coll连续密度梯度分离法最为经典。其方法为配制14个不同密度的Percoll细胞分离液，利用不同细胞的相对悬浮密度不同的原理，将胎盘绒毛中不同成分的细胞分开，可获得滋养细胞纯度可达85%,并确定滋养 层细胞在percoll中 所 处 的 密 度 值 为1.048-1.062g/L.但该方法操作繁琐耗时，稍有不慎极易导致实验失败。后续有研究[12,13]将该方法简化为35%、45%或者30%、60%两个分离梯度，王冬菊等研究[14]表明只用两个梯度根本不能将细胞很好的区分开，其将percoll密度梯度简化为10%、30%、50%、70%,细胞悬液经密度梯度离心后，在4个梯度之间均能形成明显的分离带，从上至下分别为细胞碎片层、滋养细胞层、胎盘间充质干细胞和淋巴细胞层、红细胞。并用单标法结合流式细胞术检测细胞纯度可达85%以上。之前的研究均强调收集三次消化所得的细胞悬液，但本研究建议舍弃第1次和第2次的消化液，只保留第3次的消化液。前期研究将3次消化的消化液分别经过percoll密度梯度离心后发现，前两次主要是细胞碎片层和红细胞层，第3次消化液经密度梯度纯化后可见明显的滋养细胞层，更关键是经过前两次消化红细胞和杂细胞数量大大减少，更有利于细胞计数和种板，此操作节约percoll用量，节约成本，更有利于纯化细胞。
此外，滋养细胞体外生长增殖能力低下，种植于普通培养板时，不易贴壁生长。
ECM胶主要是由蛋白聚糖、层黏连蛋白等构成，对细胞黏附、生长和增殖等起到促进作用，通过前期摸索，我们发现当培养板铺以一定厚度的ECM胶，有利于滋养细胞贴壁生长。
原代培养过程中需注意以下环节：
①取材患者的年龄越小，组织越新鲜越好，培养时容易得到活力更好数量更多的滋养细胞。
②标本应置于无菌等渗液中保持其活性，用冰盒送回实验室并在2h内进行处理，时间过长组织容易失去活性，取回的标本应用含双抗的PBS彻底反复清洗至液体清亮，因红细胞在培养过程中也会消耗培养液中养分，容易造成细胞生长受限。
③组织尽量剪成浆糊状，越碎消化越充分，消化液的体积和消化次数可以根据组织量调整，至少消化3次。
④ECM胶尽量铺薄且均匀，细胞种板前铺好胶，并置于温箱中使其充分干燥。http://www.youerw.com/
本研究在前期基础上进一步简化了实验操作步骤，一次性可获得大量且纯度较好的胎盘滋养细胞，可同时满足多种实验方法对细胞数量的需求，为日后进行滋养细胞相关疾病的研究提供重要的实验基础。