为检验lmo4b的缺失是否导致原肠胚形成后有更多的细胞补充进了前神经组织中，我们决定通过原位杂交技术来使前神经组织中的lmo4b表达可视化。在胚胎1体节时期，我们看到lmo4b的表达区域与zic1的表达区域相重叠（Fig.4D,Fig.4E放大展示了重叠部位）。Lmo4b的表达通常为神经板（np）与非神经外胚层(nne)边界间的4-5个细胞（Fig.4F）。在3体节时期，从前神经组织区域的横截面可看出，lmo4b在边界区域表达，并且在很大程度上排除了前神经板（Fig.4G箭头处）。非神经性表达在6体节时期的前神经区域的横截面中仍可见（Fig.4H箭头处），此时lmo4b也在脊中表达（Fig.4H）。因而我们得到这样的结论：lmo4b前体结构域最初的重叠与最后非神经外胚层分开有关，因而在神经边界可能存在一种左右对基因表达进行细微改良。

为进一步检验lmo4b的缺失引起的前神经组织扩张是由于允许更多的边界细胞接受神经元的命运的这一猜想，我们接下来确定zic1是否是在1体节后扩张的。我们在lmo4b玛琳注射的胚胎（Figs.4I和J）中观察到一个更大的zic1表达域，表明边界区域lmo4的缺失导致zic1表达的持续扩张。Lmo4b过表达的结果支持这个解释，zic1在2体节时期的表达量减少（Fig.4K）。我们可得出这样的结论：在较早体节发育时期的边界细胞中，lmo4b的功能主要是在神经边界减弱前神经基因的表达，因而限制细胞数量而平稳地调节神经元的命运。

4．Lmo4b通过中剂量敏感的方式负调控six3b和rx3基因在前脑和眼睛中的表达。

Lmo4b玛琳注射胚胎中扩大的前脑、中脑、视网膜及视杆与文献中描述的在斑马鱼(Kobayashi et al.,1998)和爪蟾(Gestri et al.,2005)中过表达six3b基因所产生的表型相似，表明six3b与lmo4b对同一个进程有着相反的活性。为支持这个解释，在1体节时期胚胎中已发现一个lmo4b与six3b重叠表达的相似结构域，并且关键是lmo4b玛琳注射的胚胎中与对照组相比出现一个扩大的six3b表达的区域（Fig.5A）,表明six3b基因是转录是受lmo4b直接或间接负调控的。类似的，当我们通过显微注射300pg或750pg lmo4b的mRNA进行过表达，我们发现six3b的表达域是减少的（Figs.5D和E）。过表达实验的结果表明增加或减少lmo4b活性对six3b的表达是剂量敏感的（正比）。我们确定注射较低剂量的玛琳（2ng;Fig.5B）比注射高剂量(4ng;Fig.5A)所产生的效果要弱。然后，我们确定在视觉原始细胞中直接决定增殖和细胞行为的rx3基因的表达是否也受lmo4b剂量影响。我们观察到一个与six3b相似剂量依赖的效果（Figs.5F-J）.six3b和rx3增加的表达域与我们假设的增加了的部分是外胚层的细胞补充进了端脑和眼部。

5.Lmo4b缺失导致在视泡的增殖细胞数目的增加。

    鉴于six3和rx3在前脑及眼睛对于促进细胞增殖与特化的重要作用（Bailey et al.,2004;Carl et al.,2002;Del Bene et al.,2004;Gestri et al.,2005;Stigloher et al.,2006）,lmo4b玛琳注射的胚胎前脑及眼睛所产生扩张的区域也可能是由于细胞增殖加强所产生的。为检验这种可能性，我们分别对lmo4b抑制与对照组确定处于有丝分裂细胞的数量和处于有丝分裂时期的视神经细胞数目以量化lmo4b缺失对于细胞增殖的作用。我们选择发育处于7体节时期的胚胎，这个时期是lmo4b在前神经组织高表达的时期，并且发现所有注射玛琳的胚胎在形态学与基因表达上均清楚的显示前神经原始细胞的增大现象。另外，这个时间点比six3b和rx3 mRNA出现大约晚2小时，并且我们假设会有足够的蛋白质积累对细胞增殖产生影响。

6.lmo4b过表达使端脑、眼睛和下丘脑大小减小。

lmo4b过表达中观察到的six3b、rx3和zic1表达域减少的现象支持lmo4b的功能是限制前脑和眼睛特化及发育的这个假设。我们确认了这个假设中lmo4b过表达胚胎关于眼睛和前脑发育的一些细节。在1-4个细胞时期注射lmo4b mRNA的胚胎会在整体上发生错误表达而强烈的抑制眼睛的发育，但对于端脑及下丘脑的发育似乎有一个较小的作用。受精后3天，胚胎在大小上和形态学上是类似于野生型或者对照组，而存在大量的胚胎出现眼睛的缺陷或者只有基本的发育不完全的眼睛（Fig.7B）并且出现了更多视叶前的组织。这种表型粗略的类似于six3b被突变而缺失的chokh突变胚胎（Kennedy et al.,2004;Loosli et al.,2003;Rojas-Munoz et al.,2005;Stigloher et al.,2006）。我们因此希望能得到更多的关于lmo4b在眼睛和端脑表达的细节。 斑马鱼LMO4同源基因英文文献和中文翻译(4):http://www.youerw.com/fanyi/lunwen_50722.html