将构建好的重组质粒转化进入大肠杆菌进行表达，经过对诱导时间、诱导温度、诱导前生长时间以及诱导剂的添加量等参数进行了研究及优化后，获得了稳定的甲酸脱氢酶高产工程菌株，构建了良好的辅NAD(P)H再生系统。目前甲酸脱氢酶再生NADH体系是最成功的再生系统，并已应用于工业生产，它以反应不可逆，甲酸价格低廉且较高的耐受性优势受到广泛认可[3]。

1。2辅酶再生的方法

目前，辅酶再生的研究和应用主要集中在NAD(P)H。它所参与的反应约占待开发酶促反应工艺的40%[3]。它以两种形式存在：还原态的NAD(P)H和氧化态的NAD(P)+。依赖NAD+的酶促反应要比NADP+的酶促反应多，后者大约只有前者的1/ 4。它们价格昂贵，通常比酶促反应所得产物要贵的多。现已知辅酶还原型的价格比氧化型更高，且更不稳定。因此为了推动氧化还原酶的生物催化过程的应用发展，就需开发更为高效的辅酶再生方法。

1。2。1各种辅酶再生方法的比较 

方方法

原理 应用优点 缺点

化化学法 化学试剂或衍生物能从还原型辅酶接受电子，将NADH氧化为NAD＋ 二亚硫酸盐能够作为还原剂使NAD＋还原为NADH[4] 化学试剂价格便宜；不需额外加入酶 缺乏特异性；辅酶易被钝化；化学试剂污染产物使得分离困难

电电化学法 NAD+ + H+ + 2 e = NADH 在电催化中间体进行电子的氧化还原，早期多采用直接电解还原法 电能为再生能源，成本低；检测易；过程易监控；不需要其他酶的参与，避免副产物产生[5] 特异性低；再生辅酶比活底；酶系统会由于电化学反应而受到损害；

光光化学法 激发态的光敏剂直接从NAD(P)H得电子从而将其氧化生成NAD(P)+ 有机染料如亚甲基蓝、N-甲基苯唑甲基磺酸盐等作为光敏剂 不需加酶；再生试剂不需以化学计量加入 循环次数低；所用光催化剂受到一定限制；酶在生物反应器条件下不稳定文献综述

酶酶法 NAD(P)为辅酶反应和需NAD(P)H为辅酶的酶促反应可以分别用NAD(P)H和NAD(P) +的酶法再生[6] 利用酶耦联法一个酶催化底物转化，另一个酶则催化辅酶循环再生。 选择性高；再生体系与合成体系兼容性好；过程易于监控 在一些体系中酶不稳定、速率低、产物不易分离

1。2。2研究目的及意义

氧化还原酶进行生物催化时需要辅酶的参与才能完成，但由于辅酶的稳定性低、价格昂贵等缺点，必须创建稳定性高、成本低的高效辅酶再生系统，以达到预期效果。现已运用在工业生产中的辅酶再生系统如formate/ FDH和glucose/ GDH再生体系，由于甲酸和CO2都无毒且易于除去，同时原料甲酸盐和葡萄糖价格低廉，所以具有强大的潜在实际应用意义。但其应用还是受到了限制，原因在于要用大量比较贵的辅酶去进行催化转化，在整个不断再生过程中都要使用到价格较高的NAD(H)。现采用基因工程的手段，实现甲酸脱氢酶FDH和葡萄糖脱氢酶GDH的高效表达，并与相应的氧化还原酶如乙醛还原酶（ALR）、亮氨酸脱氢酶（LeuDH）、丙氨酸脱氢酶（AlaDH）等进行偶联，构成双酶偶联体系。只要在生物催化转化的过程中不在添加大剂量的辅酶，就可提供辅酶循环再生的效果，从而达到降低生产成本，提高其工业应用价值。 甲酸脱氢酶基因工程菌中重组酶表达条件的优化(2):http://www.youerw.com/huaxue/lunwen_198999.html