AHL分子荧光法检测质粒的构建(7)
时间:2016-12-18 19:44 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。 2.3实验方法 2.3.1 扩大培养 从Top10F’菌株、126菌株及117菌株的菌种EP管中挑取单菌液于5mL LB液体培养基（含Kan）中，于37℃ 、200rpm的培养箱中，培养12h。振荡试管均匀菌液，用96孔板将其稀释至107，用200μL移液枪吸取100μL稀释后的菌液于LB固体培养基（含Kan）中，于37℃的培养箱中，培养12h~15h。菌落生长到合适大小时，将平板保存于冰箱待用。 2.3.2质粒抽提 （1）质粒抽提 ① 取1.5～5ml过夜培养的菌液，8000×g离心2min，收集菌体，弃尽上清。 ② 在沉淀中加入250μl Buffer 1，彻底悬浮菌体。 ③ 加入250μl Buffer2，立即温和颠倒离心管5～10次，室温静置2～4min。 ④ 加入350μl Buffer3，立即温和颠倒离心管5～10次混匀。 ⑤ 12000×g离心5～10min，将上清液移入吸附柱，8000×g离心30s，倒掉收集管中液体。 ⑥ 加入500μl Wash Solution ，9000×g室温离心30s，倒掉收集管中废液。 ⑦ 将Gen Clean Column重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。 ⑧ 重复步骤7一次。 ⑨ 空吸附柱于9000×g，离心1min。 ⑩ 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl～70μl Elution Buffer，室温静置1min。室温离心1min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液，取2～5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测（见图3-1），纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存。 （2）质粒检测 ① 制备凝胶 称0.3g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入30mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其凉到60℃左右，加入0.5μL溴化乙锭（EB）轻轻摇荡倒入封好的电泳板上。 ② 放胶 取出凝胶，放入电泳槽内。 ③ 上样 吸取5uL质粒，加入2μL上样缓冲液（Loading buffer）、4μL超纯水，混匀。 将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中。 ④ 电泳 连接好电泳槽和电泳仪，以100V恒压电泳。电泳35min后，关上电泳仪。 ⑤ 结果观察 将凝胶放到紫外灯成像系统下观测,记录观察到的电泳条带（见图3-1）。 （下文中若无特别说明，所提到的电泳验证皆按以上步骤操作。） 2.3.3 绿色荧光蛋白GFP的扩增 由于质粒pLuxGFPuv2上只有GFP片段的前端有AatⅡ限制性内切酶的酶切位点，要将GFP片段完整地从质粒上切割下来并接入pLuxR质粒，我们需要人为地给GFP片段加上一个AatⅡ限制性内切酶的酶切位点序列。因此，我们采用PCR扩增的方法，扩增该质粒上的GFP片段，并特别为其订购了一对引物，其中一个引物上含有AatⅡ限制性内切酶的酶切位点序列，这样PCR后所得到的GFP片段的两端将分别带有一个AatⅡ限制性内切酶的酶切位点。 以pLuxGFPuv2为模板，以gfp1031f（一端含有AatⅡ限制性内切酶的酶切位点）、gfp2841r为引物，对该质粒的GFP片段进行扩增。具体操作如下： ① 在超净工作台上，冰浴，在1.5ml EP管中加入下列物质，并混匀。 10×PCR buffer（Mg2+） 30 µL (责任编辑：qin) |