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在杭州湾地区慈溪一带样地内采集秋季的土壤，在光滩、低潮滩，中潮滩芦苇带、中潮滩互花米草带、高潮滩分别采集土样（每个土样由两个不同位置的土混合而成），用小铲子取宽5CM深5CM的土样，每个点采三个样（减少实验误差），每个样采2个平行样（分别用于线虫的鉴定和土壤含水量的测定），采一次共30个样，装于密封袋内带回实验室。

将三个平行样用于测量含水量。其中，取出部分土样置于培养皿中称重，然后将其放入烘箱内，80℃烘干至恒重，再次称重以获取剩余干重，根据公式

         含水量=（湿土重量—干土重量）/干土重量

测其含水量。

另外3个样直接用4％的甲醇固定一周以上。可用40％的甲醇原液，用水以1比9的比例配成所需浓度。在配甲醇溶液时，要注意在通风口进行或打开排风扇，保证空气流通。一般每个样品加100ml的甲醛，直接加到密封袋中，并用手将土块捏碎，使土壤中的线虫与甲醇充分混合。

2。3 线虫分离与计数

采用Ludox TM悬浮法[10]分离线虫（Ludox悬浮液通过使线虫漂浮于水上，而泥沙沉在水底的密度原理，使线虫从尽可能多的杂质中分离出来）：

1。 制备Ludox悬浮液：将Ludox TM原液倒入量筒中，根据婆梅式比重计，用蒸馏水稀释到比重为1。17。

2。 过滤：将土壤样品倒入孔径为1㎜的大孔径筛网，用清水缓慢冲洗（可用手轻轻揉搓，加快清洗速度），把植物根系、石子和大型土壤动物等较大的杂质留在筛网上。再将通过该筛网的泥样在孔径为45μm的大筛网上用清水（在水龙头上包一层纱布过滤自来水中可能存在的线虫）筛洗，洗去较为微小的泥土，最后只剩下线虫等小型土壤生物及不能滤过的少量泥沙和杂质。

3。 悬浮：用配置好的Ludox 溶液将留在孔径为45μm的大筛网上的残留物转入300ml的烧杯中（尽量沥干水分，减少水分的转入，使悬液的比重尽量维持在1。17），再加入约200ml的配制好的Ludox溶液，用玻璃棒均匀搅拌，然后静置1小时，使线虫和杂质在Ludox溶液中分离。

4。 过筛：用孔径为45μm的小筛网对烧杯中的上层清液进行过滤（注意不要将杯底沉淀物倒入小筛网中，避免收集的样品中杂质过多），线虫等小型土壤动物仍然留在筛网上，再用清水冲洗，用做好标记的塑料瓶收集并标记。如果上层清液有体积较大的漂浮物，则可把孔径为1㎜的小筛网架在孔径为45μm的小筛网上进行二重过滤（用过的小筛网要及时清洗，防止Ludox 溶液凝固堵塞筛网）。

5。 重复：将滤下的Ludox溶液再倒回原来含有沉淀物的烧杯中，将杯底的沉淀物质搅拌均匀，再静置1小时，而后按上一个步骤进行过滤。此过程重复3次，可基本将线虫收集完全。操作过程中要始终使Ludox溶液的比重保持在1。17。

6。 保存：把收集好的线虫样品用一定比例的甲醇进行固定。论文网

将分离所得的线虫样品转入200ml计量瓶中，定容，充分混匀后用移液枪取2ml至计数框中，再加入一定量的清水便于观察（一般计数框中含10-15ml溶液时便于观察），在解剖镜下计数，重复三次取平均值，以估算样品中的线虫数量。

2。4脱水与制片：

由于本次样品线虫数量较多，我们用5ml的移液枪在线虫样品中吸取1ml，并与甘油、酒精和水的混合溶液（其比例极为重要，酒精过多，水分散失过快，会破坏虫子的内部结构，对之后的鉴定产生影响；水过多，会导致脱水过程延长，拖慢实验进程。经过多次试验，我们得出其最佳比例为2：8:15）混合，放入小培养皿（直径为2。5CM）中，写上标签表明样品（如20161112 G1表示为2016年11月12日在光滩采集的样品1），再将其放入含有蓝色硅胶干燥剂的干燥器中脱水两周。当干燥器中的蓝色干燥剂的颜色变为浅红色时，要及时换一批干燥剂，以确保样品缓慢持续地脱水。脱水最后的结果为小培养皿中的水和酒精完全蒸发，只剩下甘油。 (责任编辑：qin)