细胞表面展示国内外研究现状和存在的问题及展望
时间:2016-11-23 19:27 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
| 近年来，基因表达技术的一个最令人兴奋的发展是细胞表面展示(cell-surface display, CSD)，该技术为制备高活性、低成本的有机磷水解酶（OPH）提供了一种新对策[5]。利用该技术可将有机磷农药的降解酶转运和定位到细胞表面，如此既可克服降解酶的跨膜转运的技术屏障，也无需进行酶的分离纯化[6]，因而是一种开发高催化活性、且可再生的活细胞生物催化剂的新思路。通过DNA重组将有机磷水解酶基因克隆在特定表达载体中，使OPH通过锚定蛋白固定在微生物细胞表面，被显示的OPH可保持较高的生物活性[7]。细菌细胞表面展示在细菌表面多肽文库的构建与筛选，抗原在非致病细菌细胞表面表达，环境中有毒物质的降解、口服疫苗、生物传感器等多方面显示出良好的发展潜力[2]。通过构建工程菌将OPH表达到细胞表面，直接利用OPH表面展示基因工程菌株，不需要进行细胞破碎和OPH的提取纯化，解决了OPH与底物不能直接充分接触以及在提取过程中活性损失等问题，利用表面固定有OPH的工程菌作为全细胞生物催化剂进行有机磷污染物降解成为可能，使有机磷农药污染治理成为更有前景的技术[8]。利用细胞表面展示技术不仅可以解决蛋白质跨膜转运问题，并且可以随着细胞的增殖而不断更新，避免了细胞破碎和蛋白质的纯化等繁琐步骤。最近，随着可展示大片段的锚定单元的开发，表面展示技术在有机磷降解中方面的应用得到了很大的发展。细胞表面展示技术应用非常广泛，包括活菌疫苗、多肽文库的筛选、工业酶类的展示、生物修复、生物传感器等。利用表面展示技术降解有机磷农药污染的应用主要包括构建全细胞生物催化剂，构建固定化的生物反应器，筛选改良突变体，构建生物传感器用于环境监测等[4]。 大肠杆菌细胞表面展示OPH，一方面有为数众多、特性各异的菌株可供选择，另一方面人们对它们的遗传背景、分子机制以及发酵性能等也有较深入的了解。在开发的细胞表面展示系统中，应用最广泛的数大肠杆菌表面展示系统。3780 Richins等利用Lpp-OmpA锚定单元将OPH展示到E. coli JM105细胞表面，结果表明表面展示OPH的工程菌降解对硫磷和对氧磷的速度是胞内表达OPH菌株的7倍，而且比纯化的OPH更稳定，37℃保存1个月仍具有100%的活性。张红星等以丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae) KCTC1832菌株的冰核蛋白(InaK)的N-末端作为锚定单元和以来自黄杆菌ATCC27551菌株opd基因编码的有机磷水解酶作为功能蛋白，构建了一株具有全细胞催化效应的大肠杆菌表面展示工程菌MMBL2405。对该工程菌全细胞有机磷水解酶活性的正交试验，结果表明该菌全细胞酶活性可达到0.62 U/mg，是目前国外同类工作所报道酶活性的13.7倍以上；对工程菌所携带的外源质粒在无抗性条件下的稳定性进行了测定，发现工程菌经连续转接7次和继代培养168 h后，质粒携载率仍达到60%[9]。 迄今为止，国内外文献已经报道了多种用于构建细胞表面展示体系的载体蛋白。如革兰氏阴性菌的脂蛋白、外膜蛋白、S层蛋白、自转运蛋白和细胞表面附属蛋白等，革兰氏阳性菌的S层蛋白、自溶素和芽胞衣等[2]。这些锚定单元的结构和性能的差异决定了构建细胞表面展示体系有三种方式，即三夹板融合式、N末端融合式和C末端融合式。三夹板融合式是首先确定锚定单元的空间结构，判断蛋白质的表面暴露位点，将外源蛋白的编码基因插入到锚定蛋白的基因编码序列中，从而得到镶嵌型的融合基因，但该方法对外源片段有一定的限制。N末端融合方式指锚定单元的N末端与乘客蛋白的C末端融合的构建方式，适合于C末端具有引导与定位功能的蛋白质。C末端融合方式指锚定单元的C末端与乘客蛋白的N末端相融合的方式[2]。因此，锚定单元N末端必须具有分泌和表面定位的功能，从而将C末端的融合蛋白引导到细胞表面。冰晶核蛋白就属于C末端融合锚定类型。 (责任编辑：qin) |