哈茨木霉ACCD酶功能分析(2)
时间:2019-08-30 12:48 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
② 将平板置于28℃暗培养24h-48h，挑取生长适度的单菌落接种到液体培养基PD中培养。 ③ 把接种过菌落的液体PD培养基置于摇床中摇菌28℃，180rpm，24h-30h，重复此步骤2-3次，得到活性较高且生长较好的菌落。（活化一般20-30ml液体培养基）。 1.4 哈茨木霉ACCD酶活分析 1.4.1 哈茨木霉ACCD酶诱导 根据参考文献[5-7],对哈茨木霉ACCD酶诱导 ① 无菌条件下用移液枪吸取活化好的液体PD培养基中的菌液1-2ml接种于液体PD培养基置中，后置于摇床中，28℃，180rpm，2-3天，待其代谢产生ACCD酶[4]（摇菌一般30-50ml液体培养基） ② 无菌条件下移液枪吸取20µl孢子悬浮液接到10ml SM培养基培养48h。 ③ 无菌条件下先用无菌水对菌丝进行冲洗，再将冲洗过的菌丝转接到无氨的SM培养基中培养48h。 ④ 把培养物悬浮在一半体积的Tris缓冲液0.1 mol/l（Ph8.5），匀浆，最后，取样，每个1ml，3个重复，-20℃保存。 1.4.2 哈茨木霉ACCD酶活性测定 ① 匀浆后，加入25µl的甲苯至200µl，震荡30s。加入20µl0.5 mol/L的ACC，15min 30℃（水浴），加入1ml的0.56 mol/l HCL，离心10000rpm，10min，移液枪吸取1ml上清混合于800µl 0.56 mol/l HCL中（3个10ml的EP管），加入300µl 2,4-二硝基苯肼（100ml 2 mol/l HCL中加入0.2g 2,4-二硝基苯肼），再加入2ml 2 mol/l NaOH，混匀，混合物30min 30℃（水浴）。 ② 从3个EP管中用移液枪分别吸取相同体积的1ml的混合物，即一个菌株取三个样，共三种菌株，9个样，用分光光度计测OD540，以水为对照，分别测9个小样，间隔0.5h 9个小样再重复测一次[8]。 ③ 哈茨木霉酶活测定方法：ACC为底物可见分光光度计法 ④ ACCD酶酶活测定原理：选定木霉ACCD酶作用的底物（ACC），底物在ACCD酶催化作用下，形成底物自由基，而底物自由基在特定的光波波长下有最大的吸光系数，随着底物自由基浓度的增加，吸光度值也随之增大，因此可依据吸光值（即OD值）随时间的变化的关系来计算出酶活[9]。 酶活定义以酶液事先灭活后的反应混合液为对照，以一分钟内催化氧化1umolACC所需要的酶量为1个酶活单位（U）。已知540nm处ACC摩尔消光系数ε540=6.22 × 103L/(mol•cm)[10]。 (责任编辑：qin) |