酵母法生产海藻糖的国内外研究现状进展(2)
时间:2017-04-22 15:27 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
图1.2 海藻糖合成途径 1.1.3.1 海藻糖的制备方法 （1）抽提法制备海藻糖 海藻糖最早是从复苏植物和虫茧蜜中提取的，由于原料来源有限，使得海藻糖十分稀有而珍贵。后来在酵母提取液中发现了海藻糖的结晶，海藻糖在酵母细胞中既作为贮存碳水化合物，又能调节和保护细胞抵御恶劣环境。当酵母细胞处于营养饥饿、高温、干燥或是冷冻等条件下都会通过TPS/TPP途径积累大量的海藻糖。经过尝试以酵母为原料进行商业化生产海藻糖的技术得到广泛采用。目前美国、捷克主要是利用酵母生产海藻糖。我国学者也曾对此方法进行了研究，并进行了产业化推广。此外，某些食用真菌和药用真菌的突变株或是经过遗传改造的菌株均具有生产海藻糖的巨大潜力[10]。 (2) 酵母法生产海藻糖 发酵法生产海藻糖是微生物经发酵后从培养液中提取海藻糖。绝大部分微生物都具有海藻糖累积能力，比如以砂糖为基质培养的短杆菌属、棒杆菌属，以正烷烃为碳源的节杆菌等微生物都可以累积生产海藻糖。因为使用的是高浓度的高渗发酵培养基发酵，得到的高海藻糖的营养液的成分十分复杂，不方便提取，并且精制困难，转化率低，因此应用不广。 (3) 酶合成法 所谓酶法生产是利用酶制剂所具有的转糖基作用，在离体条件下作用于底物，生成海藻糖。酶转化法制取海藻糖的途径有多种，按其作用的底物，主要分为以葡萄糖、麦芽糖、淀粉为底物的三种方法。此类方法需要高能物质UDP或磷酸盐。由于反应过程中的磷酸化产物也是糖酵解、戊糖磷酸化、糖异生和糖原分解及合成途径的中间产物，因此磷酸化酶法反应不稳定，在工业化应用中受到限制[11]。 另一种是非磷酸化法，主要有两种，一是日本林原公司所报道的双酶法[12]，即以淀粉为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，该方法海藻糖的转化率高达85%，极大的推动了海藻糖的工业化生产。另一途径是单酶法[13]，即通过海藻糖合成酶(或称为麦芽糖/海藻糖转化酶)直接转化麦芽糖生成海藻糖，该过程不需要消耗高能磷酸物质，产物简单，转化率较高，能达到70%～80%，是生产海藻糖的较好的方法[14]。 1.1.3.2 海藻糖破壁方法 (1) 高温干热破壁法： 准确称取 1g干重的酵母泥置于烧杯中，于 90℃烘箱中干热处理60min后添加 10mL预冷的蒸馏水，充分振荡悬浮后 42℃水浴 20min，然后3000r/min离心 10min所得上清液即得酵母海藻糖提取液[15]。 (2) 冻融破壁法： 准确称量 1g干重的酵母泥，加 10mL的蒸馏水，60℃水浴 10min后放入-70℃冰箱 10min，反复冻融 3 次后振荡浸提 30min，然后 3000r/min离心 10min所得上清液测海藻糖含量[15]。 (3) 酸热破壁法： 准确称量 1g干重的酵母泥，加入 10mL 0.5mol/L盐酸水溶液，60℃水浴 10min，3000r/min离心 10min后加入 10mL蒸馏水振荡浸提 30min，然后 3000r/min离心 10min所得上清液测海藻糖含量[16]。 (4) 微波破壁法： 准确称量 1g干重的酵母泥，置于 250mL烧杯中，于杯底均匀铺上一层，放置在微波炉中，微波(功率 750W)破壁 2min，加入 10mL蒸馏水 40℃浸提60min，3000r/min离心 10min所得上清液测海藻糖含量[17]。 (5) 超声波破壁法： 准确称取0.3g酵母泥，加入10mL蒸馏水溶解后，超声波(功率为750W)破壁 40min，6000r/min离心 10min后取上清液测海藻糖含量[18]。 （6）研磨破壁法： 取50mL发酵液在研钵中均匀用力研磨20min，然后3000r/min 离心 10min，取上清液测海藻糖含量[19]。 中国科学院微生物研究所利用返回式卫星对酵母菌进行诱变育种，经发酵实验获得了海藻糖质量分数达20% 以上的酵母细胞，提取的海藻糖纯度在98%以上。杨波[20]等用聚合酶链反应( PCR)克隆了115kb酿酒酵母海藻糖合成酶的基因TPS1，将该片断联接到PUC19载体上，通过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌FF4169和FF4050，对转化株的质粒DNA 酶切分析表明，均含有1.5kbPCR 克隆片断，此转化株在0.5mmol/LNaCl 高渗条件下培养生长良好并能合成海藻糖。 (责任编辑：qin) |