几种高温DNA聚合酶性质比较+文献综述(2)
时间:2017-04-26 22:57 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
20世纪60年代末、70年代初人们致力DNA的体外分离技术，Khorana等于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复过程便可克隆tDNA基因。” 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等[1]发明了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，并利用此技术扩增出人的β-球蛋白基因，并将其应用于镰刀型贫血病的基因诊断[2]。它是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法，即双链DNA在高温下变性解链成单链，在DNA聚合酶、特异性寡核苷酸引物、dNTP等的参与下，根据碱基互补配对原则复制成相同的两分子DNA[3-5]。具有操作简便快捷、灵敏度高、特异性强及对样品的耐受性好等优点[6]，因此，此项技术一经问世就在与分子生物学相关的学科领域中得到广泛应用。 PCR技术的诞生是基于DNA分子双螺旋结构模型的建立以及DNA半保留复制[7]机制的发现。1953年Waston等[8,9]在Nature上发表第一篇关于DNA分子双螺旋结构的论文，建立了DNA分子的双螺旋结构模型，同年5月他们又在Nature上发表关于DNA分子通过模板进行自我复制的讨论文章，阐明每一条链作为一个模板复制产生与其自身互补的链，同时碱基对的序列被精确地复制。早在20世纪70年代初，就有分子生物学家开始致力于基因体外分离技术的研究。Khorana[10]在1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1985年，美国Cetus公司公司人类遗传部的Mullis等[11]利用Klenow DNA聚合酶建立了具有划时代意义的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)， 并将这一技术应用于镰刀型贫血病的基因诊断。 1987年Mullis等[12,13]研究人员完成了PCR自动化操作装置，促使PCR技术进入实用阶段。1988年耐热DNA聚合酶(Taq酶)被发现并应用于PCR反应中，使PCR技术得到突飞猛进的发展[14]。1989年美国《Science》杂志列PCR为20世纪十余项重大科学发明之首，并将1989年比喻为PCR爆炸年。 1.1.2聚合酶链式反应的原理及特点 聚合酶链式反应（PCR）扩增基因的过程，类似于体内DNA复制的过程。其基本原理是在DNA模板、寡核苷酸引物、4种dNTP和耐热性DNA聚合酶存在的条件下，以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动，沿模板5'→3'方向延伸，根据碱基互补配对原则特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应（图1-1）。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。寡核苷酸引物和模板DNA结合的特异性决定着PCR技术的特异性[15,16]。 图1-1 PCR反应原理图 PCR反应中，在PCR体系中加入耐热性DNA聚合酶、dNTP与模板后，通过温度变化调控反应进程。双链DNA经过高温变性（heat denaturation）、引物退火（primer annealing）和延伸（primer extension）三步反应反复循环而完成目标DNA的扩增[17]。 （1）变性，通过加热使模板DNA内的氢键断裂，双链DNA完全变性成为单链；同时，高温也消除了寡核苷酸引物自身及引物之间存在的局部双链。双链DNA模板的变性温度由（G+C）含量来决定，模板DNA的（G+C）含量越高，熔解温度也越高。变性时间由模板DNA分子的长度来决定，模板分子越长，两链完全解开所需要的时间也越长[18]。 （2）退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA复性结合；复性温度（Ta）至关重要。Ta过高，引物与模板就不能很好的结合在一起，扩增效率也相对降低；Ta过低，两者间又易出现非特异性结合，导致非特异性DNA片段的扩增。一般来说，退火温度适于在比理论计算的引物和模板的熔解温度低3~5℃的条件下进行[19]。 (责任编辑：qin) |