复合菌剂对四溴双酚A胁迫下大豆幼苗生长及抗氧化酶的影响(4)
时间:2017-05-14 09:30 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
(3) 绘制标准曲线 将上述所配溶液依次稀释出梯度性的溶液浓度。依次是每mL含有糖0 mg、5 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg。与测定可溶性糖含量的测量方式一样测定OD值，以所读取的OD值绘制标准曲线。 1.5.2.3 结果计算 可溶性糖含量%=C×V/（W×1000000）×100% 式中：V：植物样品稀释后的体积(mL)；C：待测液的糖含量(μg/mL)；W：大豆幼苗的鲜重(g) 1.5.3 SOD活性的测定 1.5.3.1 实验试剂 0.1 mol/L的Tris溶液：1.21 g Tris+100 mL蒸馏水。 0.1 mol/L的HCl溶液：取0.1 mL的浓HCL，加蒸馏水溶解成6 mL。 50 mmol/L的连苯三酚溶液：取0.1 mol/L HCl溶液20 μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶，再往里加连苯三酚14.6 mg。 1.5.3.2 操作步骤 （1）酶液提取：取大豆幼苗叶片0.1 g在事先冷藏过的研钵内，剪碎后放入Eppendoff管中，加入1 mL（分三次加）pH为8.3的Tris-HCl缓冲液，低温下用研磨棒研磨成浆状，于4 ℃，12000 r/min下离心15 min，将离心好的上清液分别装在事先标记过的Eppendoff管里面，将其保存在-18 ℃的冰箱中备用。 （2）酶活性的测定： 表1 连苯三酚四氧化法测SOD样品测定液配制表 试剂 对照管 样品管 Tris-HCl缓冲液 8mL 80mL 粗酶液 ----- 15µL 连苯三酚溶液 ----- 10µL HCL 10µL ----- 总量 8µL 8mL 在放入连苯三酚后开始计算时间，快速混匀，尽可能地让提取液和底物反应，倒进比色皿内进行比色，用分光光度计测量吸光值，每30 s读取一次混合液325 nm下的吸光值，连续读6 min。 1.5.3.3 结果计算 酶活力=[（0.070-A325nm/min）/0.070）×100%）/50%×反应液总体 积×（样液稀释倍数/样液体积] =（1-A325nm/min/0.070）×568.8888 1.5.4 POD活性的测定 1.5.4.1 实验试剂 0.02 mol/L的愈创木酚：取0.11 mL愈创木酚加水定容到50mL。 0.04 mol/L的过氧化氢：取80 µL 30%过氧化氢加水到20mL，即配即用。0.01mol/LpH7.0磷酸缓冲液：61.0 mL0.1 mol/LNa2HPO4与39.0 mL 0.1 mol/L NaH2PO4混合加蒸馏水至1000 mL。 1.5.4.2 操作步骤 （1）粗酶液的制备：称取0.1 g洗净的大豆幼苗叶片，剪碎后放入Eppendoff管中，加入少量石英砂和1 mL（分三次加）pH为7.0的PBS，低温下用研磨棒研磨成浆状，于4℃，12000 r/min下离心15 min，将离心好的上清液分别装在事先标记过的Eppendoff管里面，将其保存在-18℃的冰箱中备用。 （2）大豆幼苗叶片CAT活力的测量：取出比色杯，加入3.0 mL 0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液和0.05 mL 0.02 mol/L的愈创木酚，作为调零空白；另一只加入3.0 mL 0.01 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液和0.05 mL 0.02 mol/L的愈创木酚和上述粗酶液1 mL，加好混合物后充分混匀，于试管内放进10 µL 0.04mol/L的H2O2溶液，立即混匀。用分光光度计测量吸光值，在470 nm下比色测定OD值，读出第2 min，第3 min的吸光值。 (责任编辑：qin) |