毕业论文移动版

牛奶中绝大部分的蛋白质都是由乳腺上皮细胞利用血液中的氨基酸（AA）从头合成的，因此氨基酸的供应对于乳蛋白的合成必然有重要影响。大量研究表明，乳蛋白合成主要受一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶--哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin ，mTOR）的影响[1-3]。mTOR包括mTORC1和mTORC2两条信号通路[4-6], 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）中mTORC1主要通过结合营养物质和氨基酸效应物支持细胞内蛋白质翻译和细胞生长等生命活动[7]。论文网

1999年，HOON等人从许多小鼠的舌头上提取出了一些味觉细胞，经过cDNA文库测序后发现了T1R1基因，并发现该基因在味觉细胞中选择性表达，以T1R1为基础进行PCR, 又鉴定出了T1R2 基因[8]，随后又在人的基因文库中鉴定出了T1R3基因。G蛋白偶联受体复合物(GPCR)T1R1/T1R3最早在味觉细胞的鲜味受体中被发现，是一种氨基酸受体[9]，他们是跨膜蛋白，在结构上完全符合氨基酸信号跨膜传递的要求[10]。多项研究证实，T1R1/T1R3可以感知大多数L型AA的刺激，引起细胞内钙水平的变化，但是对于其具体生物学功能了解较少[10-13]。近年来研究发现T1R1/T1R3不仅存在于味觉神经元中，在消化道、胰腺等多种组织和器官，以及精子细胞和多种培养细胞中均表达。这说明T1R1/T1R3可能参与氨基酸水平的感知。

经过几十年的研究之后,虽然对于哺乳动物的泌乳调控机制及信号通路有了进一步的了解,但泌乳调控机制仍不完全清楚。在过去的十年里高通量测序技术和生物信息学方法初步揭示了哺乳期的基因调控网络[14-16]。更有研究证实T1R2/T1R3能够调控葡萄糖的吸收，而T1R1/T1R3和T1R2/T1R3具有同源性和功能相似性[8]，因此我们推测T1R1/T1R3有类似于T1R2/T1R3的功能。一项最新研究证明，T1R1/T1R3可能是位于mTOR上游的氨基酸传感器[7]。这个实验说明T1R1/T1R3可感知细胞外AA，从而间接对mTORC1进行调控。更有实验证明，牛消化道和乳腺内存在感知AA的功能性T1R1/T1R3，但其具体生物学功能及其作用机制还有待进一步研究[7,13]。但是目前关于T1Rs受体家族的研究大都集中在小鼠和人的身上,而对于牛的这个受体家族的研究特别少。我们推测T1R1/T1R3二聚体通过对mTOR信号通路的调控作用从而指导乳蛋白翻译。因此，我们首先研究Lactisole对小鼠泌乳机制的影响，从而为进一步研究Lactisole对奶牛泌乳机制影响提供理论指导。通过对乳腺外植体进行处理，从而探讨T1R3对小鼠乳腺氨基酸转运的影响，进一步揭示T1R3通过mTORC1信号通路调控乳蛋白合成的机制，为奶牛乳腺泌乳调控机制、乳蛋白组成的营养调控及乳蛋白产量提供理论指导。

2材料与方法

2.1材料

小鼠乳腺。

试剂包括：一抗：GAPDH、S6 mAb、mTOR、Tubulin；二抗：羊抗兔 IgG、牛血清白蛋白、PhosSTOP（Roche, 瑞士巴塞尔）、cOmplete Protease Inhibitor Cocktail（Roche, 瑞士巴塞尔），二甲基亚砜(DMSO, Sigma)、Lactisole（Sigma, 8mM）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天有限公司）、D-Hanks液、DMEM培养液、生物显影液（遮光现配现用）、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED、1.5MTris-HCl（PH8.8）、75%酒精、100%酒精、脱脂奶粉、甲醇、TBST、ddH2O、蛋白上样缓冲液（Loading Buffer）、β-me、TBS、生理盐水、TBE缓冲液

仪器包括：FluorChem M全自动多色荧光成像分析系统（Gene Tech, Shanghai China）、Synergy 2 多功能微孔板检测仪（Synergy 2, USA）、混合球磨仪（德国）、PCR仪（Bio-RAD）、PVDF膜（Millipore）、离心机（Thermo）、水浴锅、Eppendorf移液器（1000 μL, 200 μL, 100 μL, 10 μL, 2.5 μL）、电泳槽/电泳仪（Bio-RAD）、EP管、摇床、滤纸、电子天平 (责任编辑：qin)