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1。4  检测ALP活性的传统方式及其优缺点

在临床检测中，测定ALP活性的方法主要有以下5种：(1) Gomori钙钴法：在pH9。2-9。8的缓冲溶液中，以镁离子作为激活剂，ALP能够把β-甘油磷酸钠水解并生成磷酸，而磷酸能与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理后会形成黑色的硫化钴沉淀；(2) 磷酸苯二钠法：这是一种能在碱性环境下用ALP将磷酸苯二钠水解，并生成酚和磷酸，前者能在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，再经铁氰化钾的氧化后能形成红色的醌类化合物，其颜色的深浅能根据ALP活性的高低而发生改变，ALP的活性越高，其颜色越深；(3) BCIP/NBT(四唑硝基蓝)比色法：在ALP的催化作用下，BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)能被水解，其水解产物与NBT(氯化硝基四氮唑蓝)发生反应，能形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan；(4) Kaplow法(偶氮偶联法)：在PH9。2-9。8的缓冲溶液中，ALP能将人工合成的磷酸萘酚盐水解并释放出萘酚，后者能立即与重氮盐偶联，生成不溶性偶氮色素；(5) pNPP(对硝基苯磷酸二钠)法：pNPP在ALP的催化作用下生成黄色的水溶性产物对硝基苯酚，该产物在波长为405 nm处有光吸收，通过测定其吸光度值，并与标准曲线进行比较，即可对ALP活性进行定量分析。由此可见，在临床检测中，测定ALP活性的方法主要是基于溶液颜色的深浅变化(即溶液对光的选择性吸收)来对物质含量进行定量测定的比色分析法(又称吸光光度法)，这是由于比色分析法具有设备简单、操作方便、分析时间短、准确度高等优良特性；然而，这些方法一般都存在灵敏度低、选择性差等不足，临床样品中的复杂组分也会对检测结果造成干扰，只能用于成分相对简单而显色又不易受到干扰的溶液。在基础研究领域，常用的测定ALP活性的方法除比色分析法外还有荧光测定法[26-29]、化学(生物)发光分析法[30,31]及电化学分析法[32,33]等。其中，荧光测定法是通过检测溶液的荧光吸收或发射强度，而对待测物浓度进行定量分析的一种方法，与比色分析法一样具有仪器简单、操作方便、准确度高、重现性好及易于实现操作自动化等优点，而且其灵敏度较比色分析法高1-3个数量级；然而，荧光检测同样存在内源干扰，临床样品中的脂血和溶血作用也会对检测结果造成影响。化学发光分析法是分子发光光谱分析法中的一类，由于被检测的检测液浓度与该体系的化学发光强度在一定的实验环境下能够呈一定的数量关系，通过检测其化学发光强度，能够对检测液中待测物的含量进行检测。化学发光的优点很多，包括灵敏度高、分析时间短、动态范围宽、操作简便等[34,35]。化学发光分析法也具有其缺点，就是它的发光在很短的时间就能完成，因此，它发光强度的最大值降低的时间很短，有些发光反应在短短几秒之内就能完成，而且由于光强度太大，也会造成检测的结果不能总让人满意，此外，像这样的发光试剂在市场上还很少见，因此对于该方法的使用还具有很大的局限性，因此我们不推荐使用该方法[36,37]。基于电化学检测ALP活性的方法灵敏度很高、而且测试费用低，更重要的是其操作简便并且能够仪器小型化的优点，也常用该方法进行检测，但是该方法也具有其相应的缺点，即待测样品中含有的一些组分会对检测结果造成严重的干扰，使得结果并不精确，难以满足临床诊断的要求，因此该方法还有待进一步完善。文献综述

1。5  国内外检测ALP活性的方式

为了进一步满足临床诊断对检测方法的要求，围绕ALP活性测定，近年来国内外研究人员以比色分析法为基础开展了大量的研究工作[38-44]。其中，部分检测方法是基于ALP的酶促催化作用对检测溶液中纳米颗粒的聚集状态的影响而引起溶液颜色或胶体稳定性的改变，来对ALP活性进行定量分析的。其中，汪尔康院士带领的研究团队利用ALP对三磷酸腺苷（ATP）的去磷酸化作用，基于盐诱导的聚集效应会导致溶液颜色发生改变的特性，以银纳米粒子为探针，建立了一种灵敏的、无标记的测定ALP活性的比色分析方法[38]。同样，黄承志教授基于ALP催化ATP去磷酸化使金纳米粒子的聚集状态发生改变，实现了对ALP活性的快速、高灵敏比色分析[40]。虽然金、银等贵金属纳米粒子在ALP比色分析中已获得了相当广泛的应用，显示出了较高的应用价值，但是除了检测成本较高等不利因素外，贵金属纳米粒子的合成过程相当复杂、耗时。同时，为了避免发生不可逆聚集，需要对合成的纳米颗粒表面进行修饰，使其能稳定分散在检测液体系中。例如，在Fiammengo等以DNA功能化的纳米金为探针对microRNA进行比色分析时，需将聚乙二醇（PEG）额外修饰到纳米金表面，以提高其水溶性及在缓冲液中的稳定性[45]。Jiang等借助于点击化学介导的纳米粒子聚集效应对蛋白质浓度进行比色分析时，同样用PEG对纳米金表面进行了修饰，以并提高纳米金在缓冲液中的稳定性，并降低蛋白质在其表面的非特异性吸附[46]。而且，由于目前很难获得粒径均一的纳米粒子，所以这些方法的重现性也不是很理想。此外，上述比色分析方法均只适用于成分相对简单的血清样品中ALP活性的定量分析，并不能直接用于分析实际血液样品，因此实用性不是很高。来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766- (责任编辑：qin)