不同的细菌在繁殖过程中分泌不同的信号分子来调控基因的表达,这种信号分子利用信号分子在细胞间扩散,来感知自身和周围环境中其他菌群的数量变化,当信号分子浓度达到一定阈值时就启动菌体相关基因表达,调控相关生物学功能[5]。如产生毒素、形成生物膜、产生抗生素、生成孢子、产生荧光等,以适应环境的变化,我们将这一现象称为群体感应调节(quorum sensing,QS)。这一感应现象只有在细菌密度达到一定阈值后才会发生,所以也有人将这一现象称为细胞密度依赖的基因表达(cell density de-pendent control of gene expression)。据已有的研究表明,革兰氏阴性菌通过产生高丝氨酸内酯类 (acyl—homoserine lactonase,AHLs)作为细胞间的信号分子,该信号分子以细胞密度依赖的方式调控生理特性的表达;革兰氏阳性菌利用一些小肽作为QS的信号分子来感知种内自身种群数量,协调多种基因的表达;还有一类信号分子是一种呋喃酰硼酸二酯,即自体诱导子,它在革兰氏阴性菌和阳性菌中均存在,被用来感知种间细菌数量来调控细菌自身行为[6]。
对于革兰氏阴性菌的AHLs类信号分子的特点为:均含有一个高丝氨酸内酯环和4~14个碳不等的酰基侧链,该特征性内酯环结构在质谱鉴定过程中不会破坏。
1.2 N-酰基高丝氨酸内酯
群体感应信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHL)最初发现于革兰阴性的海洋细菌费氏弧菌(Vibrio fischeri)的生物发光现象:费氏弧菌可与某些海生动物共生,宿主利用其发光捕获食物、躲避敌人及寻觅配偶,而费氏弧菌也获得一个营养丰富的生存环境。很多细菌行为都属于群体感应,如根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒的转化[7],胡萝卜软腐欧文菌(Erwinia carotovora)[8]、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[9]等毒性基因的表达,致黄假单胞菌(P.aureofaciens)[10]、胡萝卜软腐欧文菌抗生素的产生调控[11],液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)的游动[12],以及粘质沙雷菌(S.marcescens)的色素产生[13]等。
随着对细菌信号分子研究的不断深入,发现多数细菌都靠分泌AHL进行交流和协调群体行为。AHL是一类特殊的小分子水溶性化合物,可作为QS系统中的自诱导剂。不同细菌产生不同的AHL,但他们都含有相同的高丝氨酸内酯环,主要区别在于酰基侧链的铲断、饱和度及3位碳上的取代基,即N侧链的长度(碳原子数为4~18个,多为偶数,奇数中只有7)或3-碳位置的取代基(氢、羰基、羟基)的不同[14]。
N-酰基-高丝氨酸内酯类(AHLs)化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最重要的一类信号分子,并调控许多生理特性的表达[15]。但由于AHLs分子为小分子物质,且AHLs产生菌所产生的AHLs的浓度极低,因此建立有效的检测AHLs方法具有非常重要的意义。
1.3 AHL信号分子的检测方法
进入21世纪后,细菌信息交流成为微生物学研究的热门领域,人们希望能针对细菌AHL介导的QS进行干扰和促进,达到有益于人类的目的。目前,检测信号分子AHL的方法通常有3种:①理化手段,主要通过高效液相色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)技术检测纯化来自液体培养基的标本,该方法除能定量外,还能鉴定AHL的性质;②利用传感菌的生物学方法,即群体感应系统控制的色素或荧光如绿色荧光蛋白[16]的产生来检测AHL的存在;③结合物理、化学手段和生物发光的薄层层析。
1.3.1理化方法
①高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS法)[17]
色谱-质谱法(HPLC-MS 法 )所有信号分子AHL均含一个高丝氨酸内酯环和4~14碳不等的酰基侧链,该特征性内酯环结构在质谱鉴定中不会被破坏,总保持m/zl02的一个特征碎片。AHL的另一个典型特征是其相对分子质量具有172+14n,以14递增的规律。根据AHL的典型特征,以C6-HSL、N-3-OXO-C8-HSL为标准样品建立了IJC-ESI/MS检测方法,可对细菌发酵液中的AHL进行检测。用二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿提取 AHL,残余物用Cts反相半制备柱分离,洗脱液为梯度甲醇或乙腈,部分收集物用生物检测法检出,HPLC检测经过纯化的培养物上清。此法不但可对AHL进行定量还能知道样品性质。 AHL分子荧光法检测质粒的构建(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_1233.html