科学家通过对植物体内特定ARF基因的编辑，研究植物ARF基因功能缺失突变体的表型，从而揭示植物相关ARF基因的生物学功能。拟南芥作为模式生物，生长与发育的时间短，形态结构简单，遗传转化方便，基因组简单，目前的全部基因组测序已经完成，有助于拟南芥ARF基因的编辑。随着科学家对模式生物拟南芥研究的深入，23个ARF基因在拟南芥中被发现。目前人们对于拟南芥中的中ARF1、ARF2 、ARF3、ARF4 、ARF10、ARF16 、ARF17、ARF5-ARF8 及 ARF19 的研究比较深入，ARF17的突变引起植物花粉壁的缺失和雄性不育[5]，ARF18的突变导致雄性不育的表型出现，控制植物下胚轴的生长[6]。

AtARF12位于拟南芥第一条染色体上，与ARF13、14、15、20、21 和 22 组成一个基因簇，它们的核酸序列和编码的氨基酸序列具有高度的相似性 [7]。据研究发现，AtARF12在拟南芥种子发育过程中表达明显，在种子的胚和周边部位都能检测 [8]，初步推测AtARF12与拟南芥的种子的发育过程有关。目前科学家对于拟南芥ARF12基因在拟南芥整个生长发育过程中发挥的作用没有具体详细的了解。想要进一步了解AtARF12的功能，可以通过对拟南芥ARF12基因的编辑，研究其功能突变体的表型，从而分析AtARF12的生物学功能。

1。2CRISPR/Cas技术原理

CRISPR/Cas技术原本来自于细菌，帮助细菌抵御外界病毒的侵入，具有设计构建引物简单快速，脱靶率低和成本率低的优点，在2013年被改造成基因定点编辑技术，被广泛应用于基因编辑领域。CRISPR/Cas系统主要由3种类型组成，其中TypeⅡ系统在3种CRISPR/Cas系统中由于操作方便简单，被广泛运用在动植物的基因组编辑研究中，TypeⅠ型和TypeⅢ型系统则由于参与蛋白复杂，操作改造不易，实用性低。TypeⅡ系统的原理可分为三个阶段 ：第一阶段根据实验要求选择需要编辑的基因靶位点，然后设计构建一段sgDNA，带有我们所需的靶基因序列。第二阶段将带有靶基因序列的sgDNA与Cas9基因连接，一起通过表达载体转入受体细胞。第三阶段则是转入的sgDNA转录为sgRNA，与受体细胞的DNA通过碱基互补配对结合，将Cas9基因转录的蛋白准确地结合到基因组对应DNA的位置上，由Cas9蛋白切割目标DNA序列，原基因组对应位置DNA双链断裂，断裂的DNA被非同源末端连接方式修复，从而完成对基因组目标位点的编辑[9]。这项技术在2013年由张峰的研究小组在真核细胞中首次成功运用。目前CRISPR/Cas技术被拓展应用到大鼠、斑马鱼、水稻、拟南芥、人等多个物种中，标志着这种技术的不断深入研究。

本实验所用的ARF12基因敲除载体是通过CRISPR/Cas技术精确定点敲除获得，将构建好的拟南芥ARF12基因敲除载体利用花序浸染法进行拟南芥的转化，并利用潮霉素筛选阳性植株，获得ARF12基因敲除的拟南芥，为下一步研究AtARF12基因的功能做好准备。 文献综述

2实验材料与仪器 

2。1实验材料：

本实验采用由实验室培养提供的拟南芥 Columbia(Col)野生型，用CRISPR/Cas技术构建的带有AtARF12靶基因序列的的Atu- 6：：sgDNA－Cas9－p1300质粒农杆菌感受态细胞由杭州师范大学实验室提供

2。2实验仪器：

超净台、离心管、培养皿、恒温培养箱、培养瓶、水浴锅、电泳槽、PCR产物回收试剂盒(Sangon)、PCR管(250ul)、枪头等

试剂：Sliwetl-77溶液、潮霉素、PPM、液氮、氯仿、异戊醇、乙醇、DNA Ladder等