植物基因工程是在分子生物学和植物细胞工程的基础上发展起来的一门新学科[3]，主要是利用植物基因工程技术对植物的性状进行改造并培育出人们想要的具有较高实用价值的新品种[4]。这种技术与传统育种方法相比，极大程度地拓宽了植物可利用的基因库，打破了物种之间的隔离。因此，本实验的主要研究手段就是植物基因工程技术。自从1983年首次获得转基因植物之后，植物基因工程的研究发展就异常迅猛[5]，例如1985年，Horsch等[6]用烟草作为根癌农杆菌的转染对象，成功获得转基因烟草植株，并发明了简单高效且易于采纳的叶盘法。农杆菌介导法中的叶盘法也是本实验所采用的主要方法之一。

GLO是光呼吸的关键酶，而GLO-1是GLO基因家族中的重要成员。研究发现，当GLO-1基因被干扰时，GLO活性明显下降，并且GLO-1基因被干扰的植物在营养液中培养时呈现出典型的缺陷表型：叶片枯黄和生长受抑制等[7]。因此，我们可以大胆预测GLO-1基因可能在植物的抗性方面发挥重要作用。本实验转化的桂花OfGLO1基因是杭州师范大学庞基良实验室克隆得到的，是一个B类的花器官发育基因。本实验以烟草为转染对象，利用根癌农杆菌介导法中的叶盘转化法，获得转基因苗，以期探得该基因的功能，从而为桂花新品种培育和改良找到新的方向。

1材料与方法

1。1材料

烟草种子由本实验室提供，通过组织培养获得无菌苗，摘取其幼嫩叶片为本实验的转染对象。农杆菌GV3101（含桂花OfGLO1基因）和载体pCAMBIA13011- OfGLO1均由本实验室保存。Axygen试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司。论文网

1。2烟草无菌组培苗的获得

在超净台中，将烟草种子放入1。5ml 离心管中，先用无菌水冲洗2次，然后浸泡在75%的乙醇中30s，接着又用无菌水冲洗3次，再用0。1%的升汞溶液处理2min，期间轻轻摇动离心管，使种子接触更充分，最后用无菌水冲洗3-5次，每次1-2min。灭菌好的种子用无菌滤纸吸干后轻放在MS培养基中[8]，并培养在杭州师范大学生命与环境科学学院植物学重点实验室组织培养室中。培养室的环境条件为：光照强度2000lx左右，光照时长10-12h每天，温度25℃白天/18℃夜晚。待烟草苗长至3-5cm时，取顶芽于增殖培养基上，进行壮苗培养，待叶子足够大时，切取幼嫩叶片用于后续实验。

1。3烟草转化筛选压的确定

1。3。1 Hyg筛选压的确定

转化pCAMBIA13011- OfGLO1载体需要用Hyg作为筛选压，因此需取未转化的烟草幼嫩叶片，分别接种到含潮霉素 (Hygromycin，Hyg)0 mg/L、10mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、40mg/L的诱导培养基中，30天后观察材料生长情况，统计外植体的出芽率，选择可以抑制受体材料生长的最低Hyg浓度作为筛选压。

1。3。2 Kan筛选压的确定

转化pCAMBIA13011- OfGLO1载体还需要用Kan作为筛选压，所以需取未转化的烟草幼嫩叶片，以同样的方法接种到含卡那霉素（Kanamycin，Kan）的诱导培养基中，浓度梯度设置为0 mg/L、50 mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L 。30天后观察烟草的生长情况，并统计出芽率，选择可以抑制烟草生长的最低Kan浓度作为筛选压。

1。4农杆菌介导烟草转化体系的建立

1。4。1农杆菌的制备

将含有表达载体的农杆菌从-70℃冰箱中取出划平板培养，然后挑取单斑到5mlLB（50mg/L kan+40 mg/L Rif）液体培养基中，放摇床于150rpm条件下缓慢摇动培养过夜。取1ml培养液加入到20ml新的LB（50mg/L kan+40 mg/L Rif）液体培养基，继续培养并随时测定菌液浓度。当菌液浓度为OD600=0。5左右时，吸取2ml菌液到干净的离心管中，使用离心机以4000rpm的条件离心5min，过滤掉上清液。然后用1ml新的MS液体培养基重悬农杆菌两次，同样在4000rpm的条件下离心5min。最后将重悬后的菌液加入到50ml的MS+20mg/L AS液体培养基中，即为侵染液。文献综述 桂花OfGLO1基因转化烟草的研究(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_196120.html