致谢 18

1  前言来自优I尔Q论T文D网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766

全球每年的纤维素产量近1000亿吨，是最大的可再生碳资源库，可用来制造生物燃料和诸多的生化精炼品[1]。将天然纤维素降解成为可利用的糖类物质，再进一步转化成乙醇，菌体蛋白，气体燃料（如氢气）等物质，对于解决如今世界所面临的环境污染，粮食短缺，饲料资源紧张和能源危机等问题具有重要的意义。纤维素酶是实现秸秆等废弃木质纤维素水解到单糖，继而发酵生产生物乙醇和其他化工产品生产中最为关键的环节之一。

里氏木霉( Trichoderma reesei) 能够大量合成并且分泌纤维素酶，此外，在诱导的条件下，里氏木霉分泌到发酵液中蛋白总量可达100g /L[2]。里氏木霉纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活及其表达时又起到至关重要的双重作用。里氏木霉基因组中含有11个β-葡萄糖苷酶编码基因，它们编码的β-葡萄糖苷酶主要分布在糖苷水解酶第1 (Cel1a和Cel1b)和第3家族(9个)，其中Cel3a是里氏木霉胞外主要的β-葡萄糖苷酶。转录组学数据显示，β-葡萄糖苷酶Cel3a在纤维素和乳糖诱导条件下转录上调显著，是里氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶。从野生型里氏木霉基因组中克隆β-葡萄糖苷酶cel3a基因，再将其转入里氏木霉中构建转基因里氏木霉，通过测定比较野生型里氏木霉及转基因型里氏木霉的酶活，来分析β-葡萄糖苷酶cel3a在里氏木霉中过量表达对里氏木霉产纤维素酶活的影响，其中关键步骤就是将cel3a基因转化到里氏木霉中。

对里氏木霉进行转化的经典方法为原生质体转化法，但原生质体的制备和再生费力费时，而且转化的效率较低、重复性差[2]。根根癌农杆菌介导的遗传转化是目前植物基因工程中研究最为清楚和应用最为成功的遗传转化方法。1995 年，Bundock 等人率先将这一转化方法用于酵母菌的转化，并取得成功，继而在丝状真菌的遗传转化上同样取得巨大成功，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化的优点有：效率高、操作方便、重复性好、遗传稳定、拷贝数低[3]。

本研究通过根癌农杆菌介导转化法，构建丝状真菌里氏木霉RutC-30的遗传转化表达体系。拟将β-葡萄糖苷酶cel3a转化到里氏木霉RutC-30中，从而研究β-葡萄糖苷酶cel3a对里氏木霉RutC-30产纤维素酶的影响，对研究构建高纤维素酶产量的里氏木霉菌株有重要意义。

1。1  里氏木霉论文网

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称, 能降解和利用纤维素的微生物大致可分为真菌类和细菌类[4]。里氏木霉是一种好氧的丝状真菌，为多细胞真核微生物，因其纤维素酶产量较高、易于培养和控制、产纤维素酶稳定性好、且产生的胞外纤维素酶易于分离纯化、培养及代谢产物安全无毒等特点，是最常用于生产纤维素酶的菌种[5]。里氏木霉RutC-30是高产纤维素酶的代表菌种之一[6]。里氏木霉Rut-C30 是目前公认的分泌胞外蛋白能力最强、产纤维素酶系较全的工业菌株，其分泌的蛋白浓度高达40g/L[7]。

里氏木霉为好气菌，菌丝层较厚，呈现致密丛束状，生长初期为白色，平坦，生长后期因产生分生孢子而呈深绿色，菌落背面无色，有时呈浅黄色。里氏木霉菌落在PDA平板上生长快，故本实验采用PDA培养基来培养里氏木霉。在进行里氏木霉与农杆菌的共培养时，要选择用新鲜生长的孢子，否则会影响转化效率。

1。2  纤维素酶系

纤维素是 D-脱水葡萄糖吡喃型单位通过β-1，4-葡萄糖苷键连接成的线性大分子多聚物，纤维二糖是其基本单元。纤维素主要有结晶区（crystalline）和非结晶区(又称无定型区)两部分，前者结构稳定，微生物降解十分困难；后者结构比较疏松，很易被微生物降解[8]。纤维素酶是实现秸秆等废弃木质纤维素水解到单糖，继而发酵生产生物乙醇和其他化工产品生产中最为关键的环节之一[9]。此外，纤维素酶特异性高，反应条件温和，环境污染小，广泛存在于生物中，应用非常广泛。文献综述 农杆菌介导转化cel3a到里氏木霉RutC-30及其鉴定(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_201434.html