根据上述探索，本课题对大量商品猪进行采样分析并进行基因测序与数据处理，筛选出GR基因可能存在的突变位点，并根据该位点进行引物设计，利用ASPCR技术进行突变位点分型，再根据分型结果与商品猪背腰最长肌肉内脂肪含量进行比对，最后根据比对结果进行统计学分析以确定GR基因突变位点是否与肌内脂肪沉积量有相关性。

1.实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

本研究实验动物来自同一条件下饲养的杜长大，二花脸商品猪，将其颈动脉放血屠宰后，立即取背最长肌肌肉与其周围皮下脂肪组织，组织离体后立刻放入液氮罐保存。在实验室进行肌内脂肪含量测定。挑选体重约80kg商品猪150头，并对背腰最长肌进行手术分离用于DNA提取。

1.1.2实验主要试剂

Trizol；氯仿；异丙醇；乙醇；BSP试剂盒，10%TBE溶液；硼酸55g；0.5molEDTA(pH8.0)40ml；冰醋酸；核酸染液。

1.1.3主要仪器

低温高速离心机、移液枪；立式压力蒸汽灭菌器；紫外分光光度计；PCR仪；水浴锅；超净台；凝胶成像系统；电子天平；索氏抽提器，滤纸；干燥器；粉碎机，坩埚。

1.2实验方法

1.2.1组织DNA提取与肌内脂肪含量测定手术法分离背腰最长肌，提取肌肉组织的DNA，具体方法如下：1）将肌肉组织液氮速冻碾碎，置于2ml离心管中。

2）加入900ml裂解液，及30μl蛋白酶K，摇匀。

3）置于55℃水浴锅孵育过夜（加封口膜防水），直至管中无组织样液体清亮。

4）每管加入等体积（900μl）饱和酚，摇匀器上室温摇匀15分钟，10000转/分4℃离心10-15分钟。

5）取上清，置于新的2ml离心管中，加500μl饱和酚，500μl氯仿（氯仿：异戊醇=24:1），室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心10-15分钟。

6）取上清，置于新的2ml离心管中，加等体积的纯氯仿，室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心10-15分钟。

7）取上清，置于1.5ml离心管中，加入800μl无水乙醇，室温混摇15分钟，10000转/分4℃离心10-15分钟。

8）弃上清，加入1ml70%的乙醇洗涤，10000转/分4℃离心10-15分钟。

9）重复步骤8

10)空离2分钟，吸干剩余乙醇，通风处内风干，加灭菌水溶解（提前55℃预热），

-20℃保存。手术法分离背腰最长肌，测定肌肉组织的肌内脂肪含量，具体方法如下：

1）将肌肉样品放入坩埚中剪碎，然后把装有碎肌肉样品的坩埚放入烘箱中，103℃烘6小时。

2）将烘好的坩埚放入干燥器中冷却0.5小时，取出坩埚中的肌肉样品放入微型粉碎机内粉碎，将粉碎的肌肉粉末放入小自封袋中干燥保存。

3）将滤纸切成8厘米正方形纸片，精确称取1到2克肌肉粉末，（记做W1）用滤纸方块包好。

4）将滤纸包放入烘箱95到105℃过夜烘干后放入干燥器中冷却半小时后称重并记录下重量，称量后再次放入烘箱中以相同温度烘1到2小时后放入干燥器中冷却半小时后称重，直到两次差值在千分之一，记下重量W2。

5）将滤纸包放入索氏抽提器中浸泡过夜，接通冷凝水流，在恒温水浴锅中进行抽提，调节水温至55到70℃，使冷凝下滴的乙醚成连珠状，抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止。

6）抽提完毕后取出滤纸包在通风处挥发完乙醚以后放入烘箱95到105℃烘2小时，

放入干燥器中冷却并记录数据，称量后再次放入烘箱中以相同温度烘1小时后放入干燥器中冷却半小时后称量，直到两次差值在千分之一以内，记下W3。

7）利用计算公式：粗脂肪含量（%）=（W2-W3）/W1可计算粗脂肪含量。 糖皮质激素受体基因与肌内脂肪相关性的探究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_205220.html