图2.3 不同葡萄糖糖浓度和诱导时间的血红蛋白 Native-PAGE 胶图 11
图3.1 添加葡萄颗粒浸泡晶体图 18
图3.2 Biorex 70离子交换柱洗脱液的氧合、高铁和蛋白的吸收值变化图 19
图3.3 Biorex 70离子交换柱的洗脱液的光谱图 19
图3.4 亲和柱洗脱液的氧合、高铁和蛋白的吸收值变化图 20
图3.5 亲和柱洗脱液的光谱图 20
图3.6 直接结晶液滴状态图 22
图3.7 晶体浸泡变化图 22
图3.8 糖化过程样品的 Native-PAGE图 22
表2.1 糖化血红蛋白检测表 . 8
表2.2 糖化率的测定实验数据处理表 10
表3.1 HbA1c的结晶条件筛选表 . 17
表3.2 加糖血红蛋白的结晶 18
表3.3 不同结晶条件下的晶体形态表 . 21
1 绪论 随着人们生活水平的提高、生活方式的改变和社会老龄化进程的加速，糖尿病的患病率逐年增加，我国就有接近 1 亿糖尿病患者，居全球首位[1]。除了人们熟知的测试空腹血浆葡萄糖浓度和口服葡萄糖耐量外， 2010 - 2011 年美国糖尿病协会(ADA)与世界卫生组织(WHO)相继推荐糖化血红蛋白含量为糖尿病诊断的新标准，并采用HbA1c ≥ 6.5% 作为临床诊断切点[2] - [3]。HbA1c作为一种典型的糖基化蛋白，因其能反映一段时间（2～3个月）体内平均血浆葡萄糖浓度，在糖尿病的早期诊断与病后血糖水平监控方面具有重要的临床价值[4]。HbA1c 含量用于预示糖尿病慢性并发症的发生和发展，它结合血糖的检测，有助于医生更好更全面判断患者的病情，从而能及时给予患者正确的医疗指导，减少其并发症的发病率。 1.1 糖化血红蛋白 1958 年 Allen 等人使用色谱法首次从健康成人血液中分离出早于正常成人血红蛋白的洗脱成分，其中包括HbA1c [5]。1976年Bunn等人证实血红蛋白的糖基化反应是血红蛋白链的第位缬氨酸的氨基与葡萄糖的醛基在非酶促化学条件下发生可逆的亲核加成，形成不稳定的席夫碱，其中部分席夫碱经由不可逆的 amadori 重排，形成稳定的酮氨结构[6]，糖基化血红蛋白是蛋白翻译后的修饰产物，不改变蛋白的氨基酸序列。 正常成人(非糖化)血红蛋白 A0由α2β2链构成。HbA0跟糖类物质（例如葡萄糖）在非酶促化学条件下形成糖化血红蛋白（Glycohemoglobin, GHb）。GHb 根据不同糖物质种类分为葡萄糖-6-磷酸糖化、1,6-二磷酸果糖糖化和葡萄糖糖化等，由于体内游离的葡萄糖含量远高于其他糖类物质，因此体内大部分糖化血红蛋白为葡萄糖的加合物。糖化反应可发生在血红蛋白亚基、亚基的第 1 位缬氨酸主链氨基以及部分赖氨酸侧链氨基等不同位点，但这些位点的糖化概率有着巨大差异。由于：1）β 链的缬氨酸-NH2的 pKa 值接近于7，赖氨酸 ε-NH2的pKa值为10.4 – 13。在人体中性环境中，缬氨酸-NH2非质子化概率是赖氨酸 ε-NH2的100倍；2）因为构型限制，即使血红蛋白表面含有更多的赖氨酸，葡萄糖也难以靠近，因此糖化仅偏向一些特异性的基团；3）亚基周围含有较多的正电荷基团（例：His2、Lys82 和His143），更容易吸引葡萄糖靠近。所以体内大部分糖化血红蛋白为亚基氮端第 1 位缬氨酸与葡萄糖的加合物，该物质被命名为HbA 。 1.2 糖基化对血红蛋白结构与功能的影响 已有研究数据表明糖化血红蛋白含量与糖尿病并发症的发生风险有着密切联系[8]，即HbA1c含量指标每提高1%。导致冠心病和糖尿病并发症的死亡率增加20% [9]。Sen等研究报道表明糖基化相对于未糖基化的血红蛋白易发生自氧化降解，引起铁卟啉流失而导致游离铁含量的增加，催化羟基自由基形成，从而引发一系列的细胞损伤反应 [10]。Roy等人通过实验，证实细胞的氧化损伤反应是造成糖尿病并发症的发生的原因 [11]。 同时，糖基化会导致血红蛋白结构的改变（例如，蛋白分子中的-螺旋降低，疏水性色氨酸裸露），由此降低蛋白的热稳定性，减弱血红素与血红蛋白的结合力，也可造成铁卟啉流失。De Rosa 等人的实验数据显示糖基化导致血红蛋白的紧张态不稳定，表现为血红蛋白的氧亲和能力增强，但氧释放能力下降，使其氧运输能力下降[12]。许亚杰等人研究报道血红蛋白发生糖基化反应后，形成纤文结构和无定形状态[13]。 John及 Raj 等人报道，非酶促糖基化反应的重排产物（包括 HbA1c）经脱水，会重排产生高度活性的羰基化合物，这些糖基化合物和蛋白的氨基酸发生氧化缩合，最后形成中褐色，不可逆转的终端氧化产物（AGEs） [14]- [15]。这是否是引起蛋白聚集的原因之一，该研究领域仍属空白。 但是，令人惊讶的是目前蛋白质数据库 （Protein Data Bank，PDB）仅有一个非 HbA1c的糖化血红蛋白的晶体结构其糖化位点为 亚基第99位 Lys [16] 。但作为糖尿病的检测指标的 HbA1c的晶体结构还未被解析发表。对 HbA1c结构的认识，不仅有利于从分子水平上解释糖基化导致铁流失、氧亲和能力下降和血红蛋白聚集等的原因；还有利于设计药物分子用以防止和减弱 HbA1c对细胞的损伤，开发面向家用型的 HbA1c检测器。在本实验项目中，期望通过优化体外糖化制备实验条件，分离和提纯得 HbA1c 溶液，对其进行尝试结晶，希期获得 HbA1c晶体，并对其结构进行解析，为 HbA1c的铁卟啉流失等结构功能的改变和糖尿病并发症的关系提供分子结构依据。 1.3 糖化血红蛋白的分离、检测方法 一般来说，健康成人血液中的 HbA1c含量低于 6.5%，而糖尿病患者的 HbA1c含量可高达 15%-18%。对健康成人血液中的 HbA1c 进行分离提纯，对其结晶条件的筛选不现实。故我们需在体外对血红蛋白进行糖化，希望提高血红蛋白的糖化率。杨锦云等人的研究数据显示，在体外通过改变糖化的 pH、温度、所加的葡萄含量和反应时间对血红蛋白进行糖化，可得糖化率最高达 20%的血红蛋白 [17]；故我们可参考其方法优化实验条件，对血红蛋白进行糖化，得糖化率较高的糖化条件。 而现有的HbA1c分离的方法有：以电荷差异为基础：阳离子交换法、电泳等；以结构特征为差异：亲和法等；检测的方法有：以结构特征为差异：免疫法；根据化学反应性质不同：比色法、酶法等。 Bio-rex 70离子交换法[18]是实验室、临床上最常用检测 HbA1c，该方法是根据血红蛋白β-链N末端Val糖化后蛋白所带电荷不同, 在偏酸溶液中用不同pH的磷酸盐缓冲液可分次洗脱， 但其他翻译后修饰血红蛋白，诸如 HbF、HbS、HbC、甲酰化 Hb、乙酰化Hb等血红蛋白变异体，因表面净电荷与HbA1c近似，可能会随HbA1c共洗脱，从而影响HbA1c分离的纯度。2005 年 Goodall 报道该树脂分离的 HbA1c峰中仅含有 65%-75%的糖基化部分，可见其效果不理想[19]。 亲和法的基本原理是采用氨基苯硼酸与固定相基质交联作为分离介质，利用硼酸基团所携带的羟基与血红蛋白糖化所形成的顺位二元醇可逆结合，将总体糖化血红蛋白（GHb）绑定在分离介质上，使其与非糖化血红蛋白分离，绑定的 GHb成分通过山梨醇洗脱。比色法结果表明与硼酸基团结合的糖基化部分 HbA1c仅含 52%，此方法作为初步分离效果不明显[19]。但亲和层析介质硼酸基团无法与诸如 HbF、HbS、HbC、甲酰化Hb、乙酰化 Hb 等血红蛋白变异体结合，变异体的存在不会干扰测定，因此亲和层析适用人群更加广泛。 免疫法特异性好，受其他物质和环境干扰小；酶法[20]可结合常规医疗设备进行检测。但其都不能作为 HbA1c的分离提纯方法，故不做考虑。 杨锦云等人的实验证明，通过体外改变条件糖基化血红蛋白，有可能加速血红蛋白和糖化血红蛋白的降解，故仅仅得糖化率高的条件不够，我们参考涂国华等人 [21]所报道的方法，利用离子交换层析法结合硼酸亲和层析法对糖化后的血红蛋白进行分离提纯，得最高产量的糖化血红蛋白制备、分离和提纯的条件。为后续的结晶实验的顺利进行奠定基础。 在本实验中，也进行了结晶条件的筛选尝试实验，结晶受许多因素的影响，例如， pH，温度，盐离子浓度，材料，液滴形状等等；基于现有的血红蛋白[22]与糖化蛋白[23]的结晶条件，合理设计结晶实验，以期得到 HbA1c晶体。 人体血红蛋白糖基化过程对其结构影响的机理研究(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_21695.html