到现在为止，对紫薯花青素的研究主要集中食用、药用[8]方面，对紫薯C4H基因的研究尚未见报道。在国内研究过的C4H基因的材料有杜仲[9]、大豆[10]等，国外已研究C4H基因的材料有欧芹[11]、拟南芥[12]等，但是专门以紫薯作为实验材料研究C4H基因还是一片空白。本实验以紫薯叶子为材料，第一步：DNA的粗提取，采用的是CTAB法[13]；第二步：测定提取的DNA的浓度；第三步：以提取的DNA为模板，50μl体系的PCR扩增C4H基因部分序列，然后进行琼脂糖凝胶电泳；第四步：胶回收，进行T-A克隆转化感受态大肠杆菌；用LB液体培养基培养符合要求的阳性菌后进行测序；第五步：测序后的序列用DNAMAN软件进行比对分析，通过SNPs[14]分析不同紫薯品系的C4H基因的序列多样性，统计发生基因突变的位点以及突变后编码的氨基酸是否发生改变。进行这一系列的实验操作和数据分析后，对紫薯C4H基因的多样性有初步的了解，为进一步研究花青素含量变化及生物合成途径相关基因的表达调控机制提供基础信息。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 紫薯叶子

紫薯品种：NT1、NT7

2.1.2 仪器

PCR仪、水浴锅、电泳槽、紫外箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床培养、研钵、恒温培养箱、离心管、PCR管、移液枪等

2.1.3 试剂

2×CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、无水乙醇、TE（pH8.0）溶液、异戊醇、RNase、酚、氯仿、10mmol/L NaAc、X-Gal、IPTG、异丙醇、抗生素、三氯甲烷等

2.1.4 培养基

在本实验中用的是LB培养基，其配方为：胰蛋白胨10g、酵母浸出液5g、NaCl 10g、琼脂15g、蒸馏水1L、pH7.2-7.4

2.1.5 大肠杆菌培养条件

固体培养基：37℃恒温培养；液体培养基：37℃、200r/min 振荡培养12h。

2.2 方法

2.2.1  CTAB法提取总DNA

分别取3g左右两个品种的新鲜叶片，放在已灭菌的研钵中，经液氮快速充分研磨后，将粉末慢慢倾倒入灭过菌的50ml离心管中，各加入15ml 65℃预热的2×CTAB，65℃水浴45min；室温下，13000r/min×25min离心；取灭过菌的10ml离心管，将上清转移到其中，然后加入等体积的三氯甲烷：异戊醇（24：1）混匀，拧紧盖子上下颠倒轻轻晃动30min；室温下，13000r/min×25min离心；吸出上清液到灭过菌的10ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷：异戊醇（24：1）混匀，轻摇30min；室温下，13000r/min离心25min；上清液转移到灭过菌的10ml的离心管中，沿管壁慢慢加入-20℃预冷、2/3体积的异丙醇，加完后立刻混匀，然后用灭过菌的钢针轻轻搅动，使DNA析出成团；转移DNA到1.5ml灭过菌的离心管中，加入75%乙醇、10mmol/L NaAc洗涤，重复3次；10000r/min×5min离心；加95%乙醇，10000r/min×5min离心，倒去乙醇后在超净台上吹干；吹干后加入100mlTE，待DNA完全溶解后加入RNase（20μg/ml），37℃消化RNA 1h；加入等体积酚，摇匀后10000r/min离心10min；把上清吸掉，加入等体积氯仿，摇匀、10000r/min离心5min；弃上清，加入2倍体积的无水乙醇、1/10体积的NaAc沉淀，10000r/min离心10min；弃上清，加入1ml 75%乙醇，10000r/min离心5min；弃上清后在超净工作台晾干后加入200μlTE，待其完全溶解后保存在-20℃冰箱中。

2.2.2  测定总DNA浓度

用NanoDrop2000测定已提取好的NT1、NT7品种的DNA浓度，每个品系各取1μl进行浓度测定。

2.2.3  引物设计

设计引物用的是primer5，引物序列为：

94F：5´-CAGGGAGTGGAGTTCGGGT-3´

1386R：5´-GCAAGTAGGGAAGTTTATGGGTG-3´

2.2.4  引物退火温度的确定 紫薯C4H基因序列多样性分析(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_54081.html