番茄是茄科植物中重要的蔬果类作物，是研究植物发育生物学、病理分子生物学和遗传育种学等学术领域的常用的模式植物。2012年5月31日，发表在《Nature》上的番茄基因组测序的研究结果和其丰富的数据内容[16]，可以更好的为用生物信息学分析研究番茄基因组中具体的基因家族系统的提供依据。目前的研究表明,番茄的ERF基因家族组织有不同的结构特点。分析ERF基因的功能,通过测试它们的能力激活或抑制靶基因的转录活性了解到功能活动是守恒的ERF蛋白质之间共享相同的结构特点[17][18]。通过对番茄基因的克隆研究我们就会找到一些方法来应帮助提高它抗逆境的能力。番茄是研究植物生长发育与环境逆境的优良模式品种，同时它也是世界上栽培范围极广的具有高营养价值的植物品种。但是，现在番茄的栽培和生长容易受到很多环境胁迫的作用，因此研究培育出对逆境抵抗能力强的番茄新品种显得至关重要。

本课题针对提高植物抗胁迫能力这一科学问题，基于已报道的ERF基因家族的序列信息以及它们对环境逆境的响应情况，筛选出受盐和干旱胁迫显著诱导的SlERF16基因。我们将分析其序列并设计出特异性引物来克隆出它的全长序列，然后再用生物信息学的方法系统的分析其氨基酸和核苷酸序列[19]，探索其参与逆境响应的可能功能。在用生物信息学分析基因的过程中需要用到包括核苷酸及编码蛋白序列的理化性质分析，蛋白保守结构域搜索、二级结构预测，蛋白的序列同源比对等的分析方法。这些分析方法的使用可为进一步研究SlERF16基因的结构和生物学功能提供参考[19]；将两者结合起来分析植物的功能来提高农作物的产量已经成为近年来研究的热点领域。

2 材料与试剂

2.1 材料

野生型番茄AC++ (Solanum lycopersicum, AC++)栽种于温室中(光照16 h，28℃/黑暗8h，18℃)，取1个月苗龄的根、茎和叶组织为材料，用液氮速冻，于-80℃保存。

2.2试剂

PrimeSTAR® HS DNA聚合酶、Trizol试剂、M-MuLV反转录酶、DNA纯化试剂盒、克隆载体T-vector、solution I均购自大连宝生物(TakaRa)公司。DNA marker、氨苄青霉素(Amp)为sigma公司产品。

3 仪器与方法

3.1 仪器

PCR仪，摇床、超净工作台、灭菌锅、烘箱等。

3.2 方法

3.2.1 番茄总RNA的提取及反转录

取野生型番茄AC++的根、茎及叶片组织，分别提取各样品的总RNA（根据Trizol试剂说明书的方法）。通过紫外分光光度计法来测定样品中的RNA浓度，并称取1μg 样品中的RNA，根据M-MuLV反转录酶操作说明书提供的方法进行操作，以Oligo d(T)18为引物来合成cDNA。来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com

RNA提取步骤：

(1) 在研钵中倒入三分之二的药用酒精，让其燃烧，冷却后再用液氮预冷。称取0.2g番茄叶片，液氮冷却。材料研磨成粉状。

   （2) 将离心管写好标签后放入液氮预热，用镊子夹出后，将粉末状叶片装进离心管后再放入液氮，直至最后一个样品加完。

    (3) 在每管中加入1.0μLTrizol，摇匀，15-30℃静置5min。

(4) 4℃，1200r/min离心10min，取上清930μL，转到新1.5μL无RNA酶的离心管中。

(5) 加200μL氯仿，上下翻15S，常温静置3min，4℃，1200r/min，离心15min，取上清350ML，摇离心管。

(6) 加入等体积的异丙醇，混匀，常温静置10min，4℃，1200r/min离心15min，倒掉上清，离心30s.

(7) 加乙醇1μL，颠倒几下，1200r 离心5min。

(8) 吸出上清，再离心1min，吸出余下的上清；晾干，保证乙醇已挥发，加20mL DEPC水，用枪头来回吸几下混匀，吸出2mL放小离心管中，放冰水上备用跑胶。 番茄逆境响应基因SlERF16的克隆生物信息学分析(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_80707.html