2。4。3 PCR 扩增反应 13

2。4。4 目的基因胶回收与产物纯化 14

2。4。5 T 载体连接反应建立反应体系 14

2。4。6 TG1 感受态细胞的制备过程 15

2。4。7  转化 16

2。4。8  挑斑验证 PMD-STS1 16

第三章 结果与分析 18

3。1 白藜芦醇合成酶基因保守序列扩增结果分析 18

3。2 挑斑验证 PMD-STS1 结果分析 18

3。3 目的基因片段的克隆与序列比较分析 19

3。3。1PCR 产物测序结果为 19

3。3。2 将该基因与序列基因库 STS1 对比结果 19

3。3。3 桑葚白藜芦醇合成酶 STS1 基因氨基酸位点分析 22

3。4 桑葚白藜芦醇合成酶基因家族成员序列分析 22

结 论 24

致 谢 25

参 考 文 献 26

第一章 绪论

1。1 概述

白藜芦醇(Resveratrol,Res)的化学名是 3,4’,5-三羟基-1,2-二苯乙烯,它是一种多酚类 的化合物。Res 的生物性很强,是一种有效的植物防御素以及抗毒素,它对生物胁迫以及非 生物胁迫如机械损伤等可以产生抗性[1],同时 Res 还能够一定程度的抑制肿瘤,降低血液 粘稠度,对动脉粥样硬化以及心脑血管方面的疾病也能够起到一定预防的作用[2]。它可以 从花生、葡萄、虎杖、桑椹等植物中提取而来。其中,花生的 Res 的含量是相对较多的。 虽然很多的植物有合成 Res 时候需要的底物,可是却有很多缺乏合成 Res 时候所必要的关 键酶,白藜芦醇合酶（Resveratrol synthase,RS）就是其中的一个,所以有很多的植物是不能 够合成进行研究的[3]。RS 是芪合酶(Stilbene synthase,STS)的一种,芪合酶也被称作是二苯 乙烯合酶家族,即便在同一种的植物里,RS 有许许多多多的同源异构体。所以我们可以利 用基因克隆等手段,提高部分含量少的植物中的 Res 的含量,而 RS 的表达水平也和白藜芦 醇的含量有很大的联系,为此我们可以为植物品种改良提供一种手段。

1。2 白藜芦醇的理化性质

白藜芦醇的 Mp 为 265-267 ゜,它的 UV 为 210 nm,370 nm,纯度是 93%。白藜芦醇是 一 种 没 有 颜 色 的 , 呈 现 针 状 的 结 晶 体 , 它 在 乙 醚 等 有 机 溶 剂 中 比 较 容 易 溶 解 。 SMILES:Oc1ccc(cc1)/C=C/c1cc(O)cc(c1)O。它在水中的溶解度为 0。03 g/L,在 DMSO 中的 溶解度为 16 g/L,乙醇中的溶解度为 50 g/L,比较可以得知,白藜芦醇在有机溶剂中的溶解 度远大于水中。

白藜芦醇的熔点在 261-263 °C/501。8-505。4 °F,在 261℃下白藜芦醇即可升华。顺式白 藜芦醇在水中紫外吸收波长为 286 nm,反式的则为 304 nm,当它们在接受 365 nm 的紫外 光照射下的时候,白藜芦醇是具有产生荧光的能力的,而且它可以与三氯话铁-铁氰化钾 在一定的条件下发生显色反应。

1。2。1  稳定性

当白藜芦醇在接受紫外光照射的条件下的时候,它是具有发出荧光的能力的。当白藜

芦醇处于的 pH 比较大的时候,尤其当它是大于 10 时,白藜芦醇是比较不稳定的。在一定 条件下白藜芦醇可以发生变色反应,比如它和三氯化铁－铁氰化钾溶液可发生变蓝的反 应,他也可以与碱性溶液反应而变红。同时,白藜芦醇的不稳定性还有表现在它在被光照 时,有人做过关于白藜芦醇的稳定性实验,实验的结果表明了,在乙醇中的高纯度的白藜芦 醇即便是没有光照的情况下,它也只能够保持稳定性几天的时间,所以在进行白藜芦醇含 量分析的时候,我们要即用即配,不能够过早的配制好,不然有可能对白藜芦醇的稳定性产 生一定的影响。 桑葚白藜芦醇合成酶STS1基因序列克隆及分析(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96600.html