摘要细菌和古细菌在漫长的进化过程中形成了复杂的适应性免疫系统，被称为CRISPR-Cas系统(成簇聚集、规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关蛋白)，它可以靶标入侵的病毒或质粒，由crRNAs指导Cas蛋白对入侵的核酸产生特定的干扰使其失去活性。现在它作为一种强大的基因编辑工具，迅速走上生命科学领域的浪尖。78112

根据CRISPR系统的重复序列、cas基因序列和cas操纵子等功能元件的不同，CRISPR-Cas系统被划分为三个主要类型和几个亚型。为了获取Type III-B系统中CMR复合物亚基的组成及结构信息，进一步对其特异性识别和作用机制进行研究，首要任务是cmr3亚基的表达与分离纯化。本文构建了多聚组氨酸/strepII融合表达系统：在目的基因cmr3的C端连接二元亲和标签后克隆到pSeSD载体上构建表达载体pSeSD-cmr3-tag，并成功筛选出转化子，用于cmr3的表达和纯化。

毕业论文关键词   CRISPR-Cas  CMR复合物  多聚组氨酸/strep II   转化子

Title   Expression and Purification of complex CMR’s subunit cmr3 in   Thermophilic  Archaea 

AbstractBacteria and archaea have evolved sophisticated adaptive immune systems, known as CRISPR–Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins) systems, which target and inactivate invading viruses and plasmids。 The CRISPR RNAs (crRNAs)guide the Cas proteins to complementary invading nucleic acid, which results in target interference。 Now It’s becoming a hot issue in the life science as a powerful gene editing tool。 

There are major differences in CRISPR repeat sequences, in cas gene sequences and in the architecture of the cas operons。 On the basis of these differences, CRISPR–Cas systems have been classified into three main types and several subtypes。 In order to acquire the structure and conformation of complex CMR and it’s subunit in type III-B, study the unique mechanisms of RNA-guided adaptive immunity, the first thing we should do is the expression and purification of cmr3。

In this article, we design a polyhistidine /strep II dual affinity tags system, and got the right transformant finally。

Keywords  CRISPR–Cas  CMR complex  polyhistidine/strep II   transformant

目  次

1 绪论 1

1。1 古细菌与冰岛硫化叶菌 1

1。2 CRISPR-Cas系统 1

1。3 CMR复合物 3

1。4 多聚组氨酸/strep II二元亲和标签融合表达系统 5

1。5 本课题拟研究内容 5

1。6 本课题研究思路 6

2 硫化叶菌实验方法的建立 8

2。1 引言 8

2。2 硫化叶菌的液体培养方法的建立 9

2。3 硫化叶菌的固体培养方法的建立 10

2。4 硫化叶菌生长曲线的测定 12

2。5 硫化叶菌的保种方法 13

2。6 硫化叶菌基因组DNA的提取方法 13

2。7 硫化叶菌质粒的提取方法 15

2。8 实验结果与讨论 16

3 cmr3二元亲和标签表达载体的构建