3。1 引言 17

3。2 实验材料及仪器 17

3。3 实验过程及方法 20

3。4 实验结果与讨论 40

4 表达载体的电转化与转化子的筛选 42

4。1 引言 42

4。2 实验材料及仪器 42

4。3 实验方法 43

4。4 实验结果与讨论 47

结  论 48

致  谢 49

参 考 文 献 50

1 绪论

1。1 古细菌与冰岛硫化叶菌 

在某些极端的生态环境中，如陆地上的热泉，大洋底部的火山口，这些鲜有生命存活的地方，却生活着一类特殊的微生物——古细菌。古细菌又被称作古生菌、古菌或原细菌等，是一类生长在极端特殊环境中的细菌[1]。古细菌具有无核膜及内膜系统、环状DNA结构等原核生物的特征，故将古细菌归属于原核生物。但古细菌也具有真核生物的某些特征，如DNA具有内含子并能够结合组蛋白[2]。

冰岛硫化叶菌是硫化叶菌家族中的一大类代表性古细菌，极端嗜酸嗜热，最适生长温度为75℃，最适生长pH为3~3。5，由于该细菌最早在冰岛热泉中被发现，故将其命名为冰岛硫化叶菌。冰岛硫化叶菌是一类需氧型微生物，异养兼无机自养，既能够利用糖类、酵母提取物和多肽混合物进行生长，也能够将S2O32-、S4O62-、S和S2- 氧化为硫酸。拥有可移动的基因元件，如病毒、小质粒以及结合质粒；其蛋白耐热的特点又有利于对其进行异源表达纯化[3]，且相对于其它古细菌来说容易在实验室进行培养，故硫化叶菌成为了古细菌生化和遗传研究的模式生物。论文网

1。2 CRISPR-Cas系统 

CRISPR-Cas系统(规律聚集的短回文重复-CRISPR相关蛋白)是细菌和古生菌在漫长的进化过程中出现的一种复杂的适应性免疫系统，利用这个系统，细菌可以不动声色的将入侵的病毒或质粒DNA灭活[4]，这是其特有的免疫系统。

CRISPR-cas系统是高度多样性的，这可能是因为免疫系统在由入侵的MGEs所施加的动态选择压力下导致的快速演化。最初关于CRISPR基因位点的比较分析表明在CRISPR重复序列中，在cas基因序列中和在cas操纵子的构造上都存在很大的区别，以这些差异为依据，CRISPR-cas系统被分为三种主要的类型，每个类型都有一个特定的特征cas蛋白：类型1包括cas3核酸酶-解旋酶，类型2系统是通过cas9核酸酶所界定的，类型3系统拥有cas40，这是一个功能未知的大蛋白[5]，类型1和类型3系统似乎是没有关联的，然而类型2系统在种系上和结构上是独特的。为了靶定和降解目标核酸，crRNAs和cas蛋白组装成crRNP复合物[6]，它们的名字是由它们的组成所定义的。类型I-A到I-S 中的crRNP复合物被称作Cascade(抗病毒的与CRISPR相关的复合物），然而在类型II系统里，所有的crRNPs都被称作Cas9复合物。除此之外，类型III-A 中的crRNP复合物被称作Csm复合物[7]，同时那些属于类型III-B 系统的被称作CMR复合物。

类型I和类型III CRISPR-Cas系统在多种细菌和古细菌种系中被发现以多种结合体的形式存在，然而独特的类型II系统仅仅存在于细菌中（有时候也和其他的CRISPR-Cas系统相结合）[8]。有趣的是，CRISPR-Cas系统在病毒的基因组和质粒中也被发现过，这与生物种系的研究是一致的，都表明了这些系统会频繁的通过基因水平转移交换[9]。尽管它们存在各种差异，所有的Cas蛋白按照功能可以被分为四个类别：核酸酶和重组酶，这两者涉及到间隔序列的获取过程；核糖核酸酶，它催化crRNA指导的过程；与crRNAs相结合的蛋白组成crRNP复合物以便对目标的监督；以及核酸酶，负责目标DNA或RNA的降解。