本研究从6份土样中筛选得到了一株高产碱性蛋白酶的生产菌株，并对碱性蛋白酶生产菌ZD-5进行了初步鉴定。

2  材料与方法

2。1  材料

2。1。1  土样

6份土样分别采自淮阴师范学院生科院楼前花丛中土壤2份、生物科技园区内土样3份、池塘边土样1份，共6份。

2。1。2  培养基

1。 碱性蛋白酶生产菌初筛培养基

牛肉膏1。0%，蛋白胨0。5%，氯化钠0。5%，脱脂奶粉 1。5%，琼脂1。6%，pH=10。

2。 基础发酵培养基

牛肉膏2。0%, 蛋白胨0。5%,  氯化钠0。5%, KH2PO40。1%,  MgSO47H2O 0。02% ，pH=10。

2。2  方法

2。2。1 碱性蛋白酶产生菌的初筛

1。 制备土壤稀释液   称取10。0g土壤，放入装有90。0mL无菌水的三角瓶中，得到10-1稀释液，然后取1。0mL放入装有9。0mL无菌水的大试管内，依次类推得到10-2到10-7不同稀释倍数的稀释液。

2。 涂布和培养   分别取10-5、10-6、10-7稀释浓度的样品0。2mL涂布于初筛培养基，每个浓度涂布3个平皿，置于25℃培养箱中倒置培养16-18小时。

3。 观察菌体周围是否产生透明圈，并记录菌落直径(c)、透明圈直径(h)以及两者的比值(h/c)。通过透明圈直径(h)与菌落直径(c)之比，来判断菌株产酶能力的高低[3]。

2。2。2 碱性蛋白酶产生菌的复筛

从初筛的菌株中，选择透明圈直径与菌落直径之比较大的菌株作为复筛的出发菌株。将复筛的菌株分别接种到200mL基础发酵培养基中，于37℃，转速为200r/min的条件下培养24小时。最后取10mL发酵液，离心收集上清液，测定酶活力。

2。2。3 碱性蛋白酶活力的测定文献综述

采用 Folin—酚法[6]，取1mL 1%酪蛋白（用0。05mol/L pH7。0的磷酸缓冲液配制）于60℃水浴中保温 5 min, 然后加入适当稀释的酶液1 mL（使测定时OD680值为0。2～0。4间），反应10min，最后加入2 mL  0。4mol/L三氯乙酸终止反应。离心后取1 mL 上清液于新管中，依次加入5 mL 0。4mol/L Na2CO3和 0。5 mL福林试剂，于40℃保温显色20min , 用分光光度计测定680nm处吸光值。对照在反应前加入三氯乙酸，其余条件相同。在上述条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需酶量定为一个酶活力单位。所有酶活的测定（包括对照）均重复三次，以三次酶活的平均值为最终酶活。

2。2。4 碱性蛋白酶生产菌的初步鉴定

参照一般细菌常用鉴定方法[7]，对筛选出的菌种进行形态、生理和生化特征鉴定。其中形态特征包括革兰氏染色、运动性、好氧性、芽孢染色；生理特征包括菌落形态、碳源利用、氮源利用、耐盐性和需盐性；生化特征鉴定包括接触酶反应、甲基红试验、水解淀粉试验等，具体方法见文献。

3  结果

3。1 碱性蛋白酶生产菌的初筛

根据初筛方法从6份土样筛选到50株产碱性蛋白酶菌株，经纯化、镜检后斜面保存。这50株碱性蛋白酶产生菌中有20株透明圈直径(h)与菌落直径(c)之比较大，依次编号为ZD-1到ZD-20，