图1 6-氰基-(3R，5R）二羟基己酸叔丁酯生物合成转化

1 材料与方法

1。1。1菌株

E。coli BI21/pET28a-cr-X（产羰基还原酶）与E。coli BI21/pCDFDuet-gdh（产葡萄糖脱氢酶）由淮阴师范学院生物催化实验室构建、保藏。

1。1。2 培养基组成

斜面培养基，采用固体培养基，培养基组成（g/L）：蛋白胨10。0，酵母粉5。0，NaCl10。0，琼脂20。0。培养基灭菌后加卡那霉素至终质量浓度50 μg/ml。

种子培养基，采用LB培养基，培养基组成（g/L）：蛋白胨10。0，酵母粉5。0，NaCl10。0。培养基灭菌后加卡那霉素至终质量浓度30 μg/ml。

发酵培养基，采用LB培养基，培养基组成（g/L）：蛋白胨10。0，酵母粉5。0，NaCl10。0。培养基灭菌后加卡那霉素至终质量浓度50 μg/ml。

1。1。3 主要试剂

（R）-6-氰基-5-羟基-3-己酸叔丁酯由武汉泽山成生物医药技术有限公司馈赠。蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂等为市售生化材料，其他化学试剂均为市售分析纯试剂。

1。2 实验方法

1。2。1 菌种培养方法论文网

斜面培养：从菌落中挑取一接种环的菌落接种于装有5 ml斜面培养基的试管中，置于培养箱（37℃)培养12 h。

种子培养：从斜面培养基挑取一接种环的菌落接种于装有50 ml种子培养基的250 ml的三角瓶中，置于摇床（37℃、200 r/min）培养13 h。

发酵培养：用移液枪取1 ml种子培养液接种于装有50 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，置于摇床培养（37℃、200 r/min）2 h后加入诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），20℃诱导培养9 h。

1。2。2 生物催化方法

静息细胞制备：培养结束后，发酵液于4℃、6000 r/min离心5 min,收集菌体细胞，用生理盐水（质量分数0。85%）洗涤2次，离心后弃上清将菌体细胞于4℃保存备用。 

菌体细胞超声破碎：取静息细胞2 g，用预冷的100 mmol/L磷酸缓冲盐（pH 7。0）溶解菌体细胞，冰浴超声破碎20 min(功率55%，破碎1。5 s，暂停2。5 s)。

生物催化：在30 ml的磷酸缓冲液反应体系中，羰基还原酶菌体破碎液质量浓度为10 g/L，葡萄糖脱氢酶浓度为5 g/L，NADP+0。1 g/L。加入100。0 g/L底物后，摇床培养（26℃，350 r/min）转化，调节pH恒定在7。0左右，定时取样，用适宜倍数乙酸乙酯稀释后在4℃、10000 r/min下离心5 min离心后取上清液于高效液相检查。

1。2。3 羰基还原酶活力定义及测定

辅酶NADPH被氧化后，会引起 340 nm的吸光度的降低。因此可通过测定反应过程 340 nm处吸光度的变化来衡量氧化还原酶的活力。测定酶活的标准条件：总反应体积250 μL，分别加入0。5 mmol/LNADPH，5 mmol/L底物α—羟基苯乙酮，150 μL0。2 mol/L乙酸盐缓冲液（pH值4。5），30℃水浴恒温2 min，加入适量酶液后开始扫描340 nm处吸光度的变化。酶活的计算公式为

酶活（U）=EW*V*103/(6220*1)

式中，EW为1 min内340 nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，ml；6220为摩尔消光系数，L/(mol·cm)；1为光程距离，cm。酶活定义：在上述条件下，每分钟催化氧化1 molNADPH的酶活为1酶活单位。

1。2。4 产物产量测定方法 文献综述

底物（R）-6-氰基-5-羟基-3-己酸叔丁酯、产物6-氰基-(3R，5R）二羟基己酸叔丁酯采用高效液相色谱分析。色谱柱采用J&K CHEMICA®  C18反相柱（4。6 mm×250 mm），流动相为体积分数10。0%乙腈水溶液，流速控制为1。0 ml/min，紫外检测波长设置210 nm，进样量20 μL，柱温40℃[9]。

2 结果与讨论

2。1 IPTG添加时间对羰基还原酶活力的影响