本文是基于纳米粒子和氧化还原酶的直接电化学作用从而构建第三代酶生物传感器。其中，以ChOx为模型酶，研究了酶在KMWCNTs修饰的玻碳电极（GCE）上的直接电化学和它在胆固醇生物传感器中的应用。酶的固定只是通过酶分子和KMWCNTs之间的物理吸附而没有使用其他任何双功能试剂，因为固定的程序很简单，所以固定葡萄糖氧化酶电极的制备可以使用相似的物理吸附方法，这些都基于原始的或氮掺杂的MWCNTs对高活性的胆固醇含量的测定[15,16]。单独固定ChOx的电极对游离胆固醇反应敏感，而同时固定ChEt和ChOx的电极可以对酯化胆固醇和游离胆固醇同时测定。在实际血清样品的测量中，证明了使用这项技术制备的电极对游离胆固醇和酯化胆固醇测定的有效性。

2  实验部分

2。1  药品

多壁碳纳米管（MWNTs，95%，d < 10 nm）由深圳纳米港口有限公司提供，胆固醇氧化酶（EC 112-822-1，19（U）/mg）、胆固醇酯酶（EC 112-808-6，165。8 U / mg）、胆固醇、胆固醇油酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚，购买地为西格玛（圣路易斯，密苏里州，美国）。钾（K）、菲、1，2 - 二甲氧基乙烷（1，2 - DEM），β-D-葡萄糖、L-抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、乳酸（LA）和谷氨酸（GA）从西格玛–奥德里奇获得。过氧化氢（H2O2，30%）购自上海化学试剂有限公司，人类血清由南京大学医院提供。警告:人类血清是潜在的生物危害，应该采取安全措施加以处理! 所有其他化学材料均为分析等级，使用前未经纯化。用于制备水溶液的水全部为双重蒸馏水。

2。2  仪器

扫描电镜图来自于 JEOL JSM-6700F场发射扫描电镜仪。透射电镜图来自于JEOL JEM-3011 投射电镜仪。能量散射X射线光谱来自于2000XMS能仪。循环伏安和差分脉冲伏安图是在CHI 660C电化学工作站上测定得到的。电化学阻抗测量在交流电电压5 mV的Autolab电化学分析仪上进行(Eco Chemie，Netherlands)，测量液为含有5。0 mmol·L-1 K3(Fe(CN)6)/ K4(Fe(CN)6)的0。1 mol·L-1氯化钾溶液。电化学阻抗谱（EIS）记录在10−2 - 105 Hz的频率范围内的数据。电化学测量都在室温（25 ± 2 ℃ ）下的0。1 mol·L−1磷酸缓冲溶液（PBS，pH = 7。4）中进行，使用传统的三电极系统，其中一个玻璃碳电极作为工作电极，铂箔电极为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极（SCE）。

2。3  制备胆固醇和胆固醇油酸酯溶液论文网

胆固醇和胆固醇油酸酯分别用作ChOx和ChEt的基质。胆固醇原液（0。01 M）的制备是在50 mL的烧瓶中，把0。1933 g胆固醇溶解在5 mL聚乙二醇辛基苯基醚中，用60 ℃的水浴加热，再用0。1 mol·L−1 磷酸缓冲溶液（PBS）（PH = 7。4）稀释得到。和胆固醇原液的制备方法一样，胆固醇油酸酯原液（0。01 M）的制备方法是把0。1232 g胆固醇油酸酯溶解在5 mL聚乙二醇辛基苯基醚中，缓慢加热并搅拌，直到完全溶解，再用0。1 M PBS（pH = 7。4）稀释得到。然后把胆固醇和胆固醇油酸酯原液储存在冰箱里，直到观察到有轻微的浑浊。最后，把两种刚制备好的原液用0。1 mol·L−1含有1%（m/v）聚乙二醇辛基苯基醚的PBS稀释来配制不同浓度的溶液用于下一步实验。

2。4  合成钾掺杂多壁碳纳米管

钾掺杂多壁碳纳米管（KMWCNTs）的钾掺杂是通过化学合成的方法，在室温下进行的。详细的合成过程如下[12]。简言之，多壁碳纳米管（MWCNTs）在浓硫酸和浓硝酸的混合物中（体积比为1：3）预处理4 h。处理过的MWNTs用双重蒸馏水过滤和清洗，然后在60 ℃下进行真空干燥。之后，菲/钾混合溶液是由钾（与MWCNTs的重量百分比为200%）与0。2 mol·L-1的菲（98%）在20 mL 1，2-二甲氧基乙烷（99。5%）溶液中反应制得。然后，将处理过的MWCNTs（20 mg）添加到菲/钾混合溶液中，进行碳纳米管的钾掺杂。最后在280 rpm的室温下，在磁力搅拌棒进行搅拌的条件下反应48 h。反应后的产物用乙醇进行完全洗涤，重复数次，然后在60 ℃空气中干燥。