BtuD作为三磷酸腺苷的结合盒在膜表面的下面暴露在细胞质中。BtuC作为跨膜蛋白镶嵌在膜上并作为转运的门户识别维生素B12 。因为BtuD亚基看起来与跨膜的BtuC亚基紧密联系，所以有猜想两个BtuD结合盒可能有两个翅，就像窗户的两个窗子一样。这样这两个ABC结合盒亚基可以影响到跨膜亚基BtuC，从而使BtuC的两个亚基打开，即使转运通道打开 。BtuCD的结构研究促成了其所隶属家族ABC转运蛋白的许多突变体的再评价，而且为生物化学领域的研究设计了新的研究方法，比如在转运周期是可以探测结构变化的定点诱变法 。BtuCD的结构为中间状态的结构研究扫清了障碍，这样就可以使我们对中间状态的结构研究提供了方便。鉴于存在一种通用的机制，ABC转运蛋白的进口和出口的运作机制就有可能一样。有学者推测ABC转运蛋白的的进口和出口都直接进行ATP的水解来释放物质到外部。但是这些只是猜测，BtuCD进口蛋白与出口蛋白的结构需要更精细灵敏的技术进行深入的研究。文献综述

1。5  膜转运蛋白BtuCD质谱解析思路

目前观测BtuCD蛋白的手段X-射线法是在高能量下进行的，这样由于蛋白质结构的变化和一系列副作用会导致研究结构的失真 ，而新兴的非变性质谱技术能实现在低能量下解析BtuCD蛋白的结构。因此，本课题拟采用非变性质谱技术研究BtuCD蛋白与ATP/ADP及辅助因子的结合进而表征蛋白的结构和相关机制，并尝试将多肽类表面活性剂替代常用的去污剂DDM以获得低能量状态下的BtuCD质谱特征并进行优化分析，进一步利用非变性质谱研究BtuCD与ATP/ADP及辅助因子的结合及相关的拓扑构象变化。

本毕业设计的主要研究内容是利用分子克隆技术构建获得两种不同结构的BtuCD蛋白的表达株。第一种是将BtuC、BtuD基因在pET28中融合表达：首先是运用PCR技术从大肠杆菌基因组中扩增到目标蛋白序列，然后利用克隆载体将BtuC、BtuD基因依次插入到pET28的多克隆位点中形成融合蛋白，因为pET28载体含有6*His的标签可以方便后续表达蛋白的纯化，进而为质谱分析提供原料。第二种是将BtuC与BtuD蛋白基因分别插入到一载体pRSFDuet－1的两个不同的多克隆位点上构建两个蛋白独立表达的载体，并转化到表达菌株BL21（DE3）中获得表达株系,这些表达株系的建立为后续BtuCD蛋白质的表达和纯化奠定了基础，也为利用非变性质谱技术解析BtuCD蛋白在多肽类表面活性剂下的相关特征提供了可能。

2  实验仪器、材料和实验基础操作方法

2。1  实验仪器及材料

2。1。1  菌种

     大肠杆菌DH5α，克隆菌株，用于载体的构建转化；大肠杆菌BL21，表达菌株，用于蛋白质的表达。

2。1。2  质粒

     质粒即载体，目的基因连接到载体上可以在细胞中独立复制、表达，同时载体上有多克隆位点，供外源基因选择合适的酶切位点进行插入。载体同时要具有一定的选择压力标记，如pET28为抗卡那霉素，pTG19有抗氨苄青霉素，这样有利于质粒的筛选与表达。pET28，大小5369bp，表达载体；pRSFDuet－1，改进的表达的载体，可同时表达多个不同蛋白，在本课题中用于同时表达BtuC与BtuD蛋白。pTG19，大小2。9 Kb，克隆用T载体，可以直接连接PCR产物，使PCR产物更加易于操控，且可采用蓝白筛选，白斑是有PCR产物插入的转化子，蓝斑是载体自连。

2。1。3  酶与试剂盒来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

DNA限制性内切酶（Nde I BamH I Nco I Xho I）,DNA T4连接酶，质粒抽提试剂盒，基因组抽提试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，DNA回收试剂盒。