摘要：细胞自噬是细胞在自噬相关基因（autophagy-related gene，Atg）的调控下利用溶酶体（酵母和植物中为液泡）降解自身受损的细胞器和大分子的过程。该过程还受到一些参与囊泡运输和磷脂代谢的基因的调控。酿酒酵母中SPO14编码的磷脂酶D（PLD）是一类重要的磷脂水解酶，参与了膜运输及降解、脂降解等生物过程。此外，Spo14在酵母进行减数分裂，四分体孢子形成过程中发挥作用，而孢子形成过程需要细胞自噬参与。动植物中，PLD1通过影响Atg8/LC3-PE的偶联参与细胞自噬。由于Spo14的定位需要Osw1，且Spo14与Sma1存在互作，本研究将探讨Spo14及其相关蛋白缺失是否影响细胞自噬过程中磷脂与自噬蛋白的偶联参与细胞自噬，从而调控饥饿条件下二倍体产生四分体孢子。研究结果显示，无论在单倍体还是二倍体中，Spo14缺失均不影响细胞自噬过程；Spo14缺失的二倍体酵母不能产生四分体孢子。推测酵母中的Spo14并不像动植物中的PLD一样，影响Atg8/LC3-PE偶联参与细胞自噬。86086

毕业论文关键词：细胞自噬；酵母；SPO14；孢子形成

Investigate whether phospholipase D in Saccharomyces cerevisiae functions in autophagy

Abstract：Autophagy is regulated by autophagy-related genes to degrade intracellular damaged organelles and macromolecules in the lysosomes (vacuoles in yeast and plants)。 Furthermore, autophagy is also regulated by genes involved in vesicle trafficking and lipid metabolism。 SPO14 encodes phospholipase D (PLD) in Saccharomyces cerevisiae。 PLD is an important phospholipid hydrolase。 The recent studies showed that it is involved in membrane trafficking and membrane degradation, lipid degradation and so on。 Spo14 plays a role in sporulation during yeast meiosis, which requires autophagy。 PLD1 in plants and animals are involved in autophagy by affecting Atg8/LC3-PE conjugation。 Osw1 is required for proper localization of Spo14 and Spo14 further interacts with Sma1。 This study is going to investigate whether Spo14 and its related proteins play a role in autophagy。 Results showed that the absence of Spo14 in haploid or diploid did not affect autophagy, although tetrads did not form in diploid without Spo14。 We speculated that Spo14 did not affect Atg8-PE conjugation as PLD1 did in plants and animals。

Key words：autophagy；Saccharomyces cerevisiae；SPO14；sporulation

目  录

摘要1

关键词1

Abstract1

Key words1

引言1

1  材料与方法2

1。1 材料2

1。1。1菌株与质粒2

1。1。2培养基2

1。1。3试剂3

1。1。4仪器3

1。2方法3

1。2。1酵母交配3

1。2。2酵母基因组DNA的提取3

1。2。3基因敲除 4

1。2。4从大肠杆菌中提取质粒DNA5

1。2。5酵母转化5

1。2。6荧光观察6

1。2。7 Western blot6

2  结果与分析7

2。 1单倍体中Spo14、Osw1和Sma1缺失不产生自噬缺陷 7

2。 2二倍体中Spo14缺失不产生Cvt途径和非选择性途径自噬缺陷8

2。 3 Spo14缺失影响二倍体孢子形成 11

3  讨论11

3。 1 Spo14及相关蛋白缺失不影响细胞自噬 11

3。 2 Spo14缺失影响二倍体孢子形成 12致谢12

参考文献12

附录一 培养基、常备试剂与缓冲液的配制 14

附录二 本论文中用到的引物19

探讨酿酒酵母中磷脂酶D是否在细胞自噬中具有功能

引言

细胞自噬(Autophagy)是真核生物中一类进化上保守的亚细胞降解途径。它泛指溶酶体(Lysosome)(酵母或植物中为液泡，Vacuole)参与降解长寿命蛋白质或有损细胞器的过程。降解后得到的产物如氨基酸等被运回细胞质，重新利用。细胞自噬可在饥饿、低氧、渗透压异常等环境下被诱导产生[1]。自噬在真菌繁殖过程中起重要作用，比如孢子形成。根据包裹底物分子及运送至降解细胞器方式的不同，细胞自噬可分为三类：巨自噬(macro-autophagy)，微自噬(micro-autophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。其中，巨自噬为我们通常所说的自噬[2]。酿酒酵母中，细胞自噬既可以是非选择性的，也可以是选择性的。酵母的选择性细胞自噬主要包括：Cvt(Cytoplasm to vacuole targeting)途径、线粒体自噬(Mitophagy)、过氧化物酶体自噬(Pexophagy)[3]。细胞自噬的过程主要分为：起始、成核、扩展、自噬体形成、吞入及融合和降解及循环几个步骤。在自噬相关基因(Autophagy-related genes，ATG)的调控下，由大约19个核心Atg蛋白参与自噬过程[1]。其中Atg8是一个泛素样蛋白，它与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)偶联，调控自噬体形成过程中自噬泡的延伸。它是唯一一种可靠的可反映自噬水平的蛋白标记[2]。可通过检测Atg8的量来衡量细胞自噬水平的高低。在动植物中，Atg8的同源蛋白是LC3。