基于磁珠分离技术的氯噻啉上转换荧光免疫分析方法的研究(4)
操作方法是通过调整实验参数（MNPs用量20 μL~140 μL，pH 5~9，钠离子浓度0.1~0.4 M，甲醇含量0%~10%，温育时间20 min~100 min）并用上述免疫方法进行检测。数据评估基于Fmax/IC50值，选择IC50与空白对照的荧光强度的比值是最大值时为最优。通过改变荧光强度ΔI（ΔI=I0-I，I0和I分别代表无、有氯噻啉时的荧光强度）和氯噻啉浓度对数建立标线，并计算出其抑制中浓度（IC50）[10]。
1.2.6.1 MNPs用量
改变与氯噻啉抗原标记的MNPs用量（20、40、60、80、100、120、140 μL），分别建立标准曲线，考察氯噻啉抗原标记的MNPs用量对其灵敏度的影响。
1.2.6.2 钠离子浓度
在抗原抗体反应体系中，盐离子的浓度对反应结果的影响也是很重要的，因为有盐离子存在，可以减少反应溶剂的基质效应。配置一系列Na+浓度（0.1、0.14、0.2、0.3、0.4 M）的PBS缓冲液，分别建立其标准曲线，通过标记其IC50来考察Na+浓度对其灵敏度的影响。
1.2.6.3 pH值
使用PBS溶液分别将其pH值调至5、6、7.4、8、9，然后在上述pH体系下分别建立其标准曲线，通过标记其IC50考察pH值对其灵敏度的影响。
1.2.6.4 甲醇含量
使用不同甲醇含量（0、2.5%、5%、10%）的PBS缓冲溶液配制氯噻啉标准溶液，分别建立其标准曲线，通过标记其IC50考察甲醇含量对反应体系的影响。
1.2.6.5 温育时间
改变抗体标记的UCNPs和抗原标记的MNPs的温育时间（20、40、60、80、100min），考察温育时间对反应体系的影响。
1.2.7 选择性评价（交叉反应）
选择性评价是通过交叉反应率进行比较的：
CR = (氯噻啉的IC50 / 氯噻啉结构类似物的 IC50) × 100%。
配制系列浓度的氯噻啉及其结构类似物的标准溶液，结构类似物包括：噻虫啉、噻虫嗪、吡虫啉、呋虫胺、烯啶虫胺、啶虫脒。采用建立的上转换荧光免疫方法测定氯噻啉及其结构类似化合物，建立标准曲线和计算抑制中浓度(IC50)，交叉反应率CR%[11]。
1.2.8 添加回收实验
添加回收实验中所使用的空白样品包括稻田水、土壤、水稻、梨、桃、小麦、番茄和小白菜均采集于南京。
稻田水（10 mL）过滤后加入已知浓度的氯噻啉标样（5，20，100 ng/mL），直接用2×硼酸盐缓冲液混合测定。
其他样品（10 g）匀浆后添加已知浓度的氯噻啉（10~500 ng/mL），加入20%甲醇的10 mL PBS提取，涡旋3 min，超声处理15 min，如此重复提取两次。4500 rpm离心5 min后，取上清液25 mL转移至容量瓶中，用PBS定容。用优化后的缓冲液适当稀释后检测氯噻啉浓度[12]。
每种样品每个浓度设3个重复并设空白对照，用优化后的方法进行检测，计算方法的回收率和变异系数。