云实内生菌Chaetomium globosumYSC5次生代谢产物研究(3)
二氯甲烷（CH2Cl2）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司；
乙酸乙酯（EtOAc）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司；
二甲亚砜（DMSO）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司；
无水乙醇（CH3CH2OH）分析纯（AR）：南京化学试剂有限公司；
1.1.5 试剂盒
植物基因组提取试剂盒Nucleic Acid Purification N1191 广东东盛生物 广东
PCR Kit P2052 广东东盛生物 广东
凝胶回收试剂盒 purification kit Cat. DP1501，Bioteke Corporation 北京
1.2 实验方法
1.2.1 菌株YSC5的液体发酵
将储存于4 °CPDA斜面培养基上的云实内生真菌YSC5取出，置于超净工作台中无菌操作，取一小块放在含PDA固体培养基的培养皿中央，置于25 °C恒温培养箱内活化培养3d。3d后，将活化好的平板在无菌条件下用圆形打孔器（直径0.5 cm）在近菌落边际打出若干圆形菌饼，用接种针挑选出12个菌饼，放入含有400 mL PD液体并已做过灭菌处理的培养基的1000 mL锥形瓶中，置于旋转式摇床上，以150r/min，25 °C漆黑振荡的条件培养12d。12d后，用100目尼龙网过滤其发酵液，得到其菌丝和发酵液，另部分发酵液经0.22 μm滤膜过滤后获得无菌发酵液（FB），4 °C保存。
1.2.2 菌株YSC5不同有机溶剂提取物的制备
菌株YSC5发酵液分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、依次萃取，浓缩蒸干，得到各有机相萃取物。
1.2.3抗菌活性实验方法
1.2.3.1平板对峙法
内生菌YSC5与植物病原菌平板对峙法采用两点对峙培养法[10]。对内生菌YSC5和9种植物病原菌进行活化，待其菌落长至平板总面积3/4时，将灼烧过的无菌打孔器（直径5 mm）分别在YSC5和病原菌菌落的边缘打取直径为5 mm的圆形菌饼，鉴于病原菌的生长速度快，所以先将内生菌YCS5接种于PDA平板内一条直线的一点上，3d后内接种病原菌的菌丝块处在同一直线的另一点上，且两点相聚4cm。平板背面标记内容包括相对应的菌落名称、日期等，空白对照是只接种病原菌的PDA平板，处理和对照全部设为3个重复。将平板置于25 °C培养箱中恒温培养3-7d左右，每天观察处理组和对照组病原菌菌落、菌丝的生长速度、菌落之间是否有抑菌带出现、菌落边缘菌丝是否有稀疏和萎缩畸形等现象发生。如出现了抑菌带，那么抑菌带（或抑菌圈）面积越大，就表示该内生真菌对该病原菌的抑菌效果越强。
1.2.3.2菌丝生长抑制法
利用菌丝生长抑制法，测得菌株YSC5的发酵液与发酵液的各项有机相萃取物对9种植物病原菌的抑制活性作用。就菌株YSC5发酵液而言，将无菌发酵液和PDA培养基混合倒入平板，稀释10倍，就菌株YSC5不同有机相提取物而言，终浓度为25 μg/mL。含药平板制作完成以后，用直径5 mm无菌打孔器（已灼烧）在YSC5及病原菌菌落的边际打圆形菌饼，放至培养皿中心，于25 °C恒温黑暗环境中培养。直至阴性对照菌株生长至培养皿边缘时，采用十字交叉法计算菌株直径（除去菌饼5 mm），计算抑制率的公式为(1-a/b) × 100%，其中a值代表含药组的菌株直径，b值代表空白对照组的菌株直径，而后用公式计算抑制率。
1.2.3.3化合物有效抑制中浓度（EC50）测定
采用菌丝生长抑制法（见1.2.3.2）测定分离所得化合物对供试植物病原菌（1.1.1）的抑制活性。从中选择供试样品的条件为其对植物病原菌的相对抑制率较高，用供试样品测定计算它的有效抑制中浓度（EC50），过程如下，用二甲亚砜（DMSO）溶解供试样品，将溶液与PDA培养基混合，配制出不同终浓度的含药平板，用打孔器（直径5 mm）在已培养好的植物病原菌菌落上打取菌饼，分别接种到平板的中间位置，每个处理设置3次重复，并以只加DMSO不含样品的PDA平板作为空白对照。25 °C黑暗环境下培养一段时间，采用十字交叉法测定计算菌落直径，得出相对抑制率。实验结果则用Microsoft Excel软件进行数据归纳和整理，将供试样品质量浓度（μg/mL）设为X轴，抑制率（%）设为Y轴，求得抑制活性的回归方程，从而计算出有效抑制中浓度（EC50）。阳性对照是多菌灵。
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