生物脱氮是近年来的研究热点，越来越多的硝化细菌和反硝化细菌被挖掘和研究。与传统的细菌厌氧反硝化相比，好氧反硝化细菌更具有独特优势：①反硝化过程在好氧条件下进行，并能使其与硝化过程同时进行，可将铵态氮在好氧条件下直接转化成气态产物。②大部分好氧反硝化菌适应度较强、生长速度快、产量高并且对溶解氧浓度要求较低，反硝化速度快且彻底，适合治理大面积氮污染水域[8]。好氧反硝化作用是实现同步硝化反硝化的关键，而进一步发掘好氧反硝化菌资源，并对其进行深入的研究是实现好氧反硝化的关键[9]。

本研究以西溪湿地土壤样品作为分离材料，筛选分离得到一株高效的好氧反硝化细菌CD1，对它的除氮特性进行了研究，以期为生物脱氮的理论和应用提供参考。

1 材料与方法

1。1 样品采集

土壤样品采自杭州西溪国家湿地公园。取表层土壤（0-10cm），4℃冰箱保存，用于富集分离。

1。2 培养基

好氧反硝化菌富集培养基：NaNO2 2。0 g、柠檬酸5。0 g、KNO3 0。5 g、K2HPO4 1。0 g、KH2PO4 1。0 g、MgSO4·7H2O 0。2 g，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2-7。6。

好氧反硝化菌分离培养基（BTB培养基）：KNO3 1。0 g、NaNO21。0 g、KH2PO4 1。0 g、FeCl2·6H2O 0。5 g、CaCl2·7H2O 0。2 g、MgSO4·7H2O 1。0 g、琥珀酸钠8。5 g，琼脂20。0 g， 1。5% 溴百里酚蓝1。0ml/L，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2。论文网

反硝化培养基：KNO3 3。0 g、KH2PO4 1。0 g、FeCl2·6H2O 0。5 g、CaCl2·7H2O 0。2 g、MgSO4·7H2O 1。0 g、琥珀酸钠8。5 g，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5。0 g、蛋白胨10。0 g、NaCl 5。0 g，琼脂20。0 g，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2-7。6。

脱氮特性培养基：KNO3 3。0 g、NaNO2 3。0 g、柠檬酸三钠5。0 g、K2HPO4 1。0 g、KH2PO4 1。0 g、MgSO4·7H2O 0。2 g，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2-7。6。

1。3 仪器设备

722型分光光度计（上海江仪仪器有限公司）；WH861型漩涡振荡器（江苏太仓华利达实验室设备公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台）；GI54DS型高压蒸汽灭菌锅（厦门致微仪器有限公司）；FPG系列多段可编程光照培养箱（宁波莱福科技有限公司）；微量移液器（德国Eppendorf）；5417R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf）； DM6000B光学显微镜（德国Leika）；冰箱（Hair集团）；凝胶成像系统（Tanon）；电子天平（Mettler Toledo PL203）；pH计（Mettler Toledo DELTA 320）；磁力搅拌器（JB-3）；HH-4型恒温水浴锅（金坛市富华电器有限公司）；电热鼓风干燥箱（101-2型）。

1。4 菌株分离与筛选

分离：取10g土壤样品加入100ml富集培养基中，30℃、160r/min摇床上振荡培养，每隔24h向培养液中加入5% KNO3和5% NaNO2溶液各1ml，重复上述操作培养3d。用无菌水将上述的富集培养液进行适当稀释后，吸取0。2ml涂布于BTB培养基平板上，30℃恒温培养2-3d。从BTB培养基平板中挑选出蓝色晕圈的单菌落，平板上连续划线分离，直至获得纯培养物，4℃斜面保存。

初筛：将上述分离得到的菌株接种到100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、160r/min摇床培养活化24h，取50mL菌液，于5000r/min离心10min，弃上清，再用0。85%生理盐水洗涤沉淀，再次离心，如此重复3次，以去除菌体产生的无机氮素，最后用10mL生理盐水制备菌悬液，取1mL接种到100mL反硝化培养基中，30℃、160r/min摇床培养48h。取1mL培养液，加入少量格里斯试剂混匀，观察颜色变化。当培养液中滴入A、B液后，溶液如变为红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在；若无红色出现，则可加1-2滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐，无亚硝酸盐；如果不呈现蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已还原成其他物质。