4。2。1 选择基因 8

5 总结与展望 10

5。1 总结 10

5。2 后期展望 10

参考文献 11

致谢词 12

1 引言

1。1 基因编辑技术的发展与应用

在生命进化历史上，CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是细菌与病毒进行抗争时产生的免疫性武器[1]。简单来说就是病毒能把自己的基因通过一系列活动整合到细菌遗传物质上，进而能够利用细菌的细胞工具完成自身的基因复制工作，而细菌为了把来自病毒的外来入侵基因清除掉，从而就演化出了这样一套CRISPR系统。利用这个系统，细菌就能够顺利地把外来的病毒基因从自己的染色体上切除，保证了自身遗传物质稳定且不受外界干扰，这就是细菌所特有的免疫系统[2-3]。许多微生物学家在大约十几年前就已经发现并了解到细菌这一特殊生物拥有的多种切除外来病毒基因的防御功能，并通过大量的实验研究发现，在此防御功能中，比较典型的模式是依靠特殊的复合物进行的，这类复合物能够在一段特殊的RNA 的指导下，定向寻找目标DNA序列并与之匹配，然后顺利地将该序列进行切除。不同细菌中承担该免疫防御功能的复合物各不相同，许多细菌中的免疫复合物都相对复杂。其中科学家主要掌握着一种蛋白操作技术，即蛋白Cas9。科学家利用该蛋白对多种目标细胞的DNA成功实施了切除[4-6]。由此，这种技术被命名为CRISPR/Cas9基因编辑系统。由于多项优点，该技术迅速发展成为生命科学最热门的技术并受到了生物科学界的无比青睐。来自优W尔Y论W文C网WWw.YoueRw.com 加QQ7520,18766

随着生物科学的发展进入到分子时代，分子技术手段的使用在生物科学的实验研究中的重要性不可小视，尤其是基因编辑技术。近年来，由于基因编辑技术能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除或加入等，有着其他分子技术无可比拟的优势。因此，在生物学领域研究中越来越多地使用这种基因编辑生物学技术，对基因进行编辑操作。基因编辑技术从发展至今，已经历了三代技术的变迁[7]：

（1）现代基因敲除技术的先军：ZFN（锌指核酸酶，zinc finger nucleases），该技术的诞生在科学界被誉为空前的变革，它虽然能以极高的精确度和效率对特定的基因组进行编辑，但高昂的成本和普适性不高的缺点使其的广泛应用遭遇到了瓶颈。

（2）现代基因敲除技术的典范：TALEN，TALEN借鉴了ZFNs的技术，在21世纪初广泛地被运用于基因敲除，并取得了相当大的成功。

（3）当代基因敲除技术的新宠：CRISPR/Cas9，该技术具有的重要优势是其只需要Cas9酶、能够识别靶位点DNA序列的向导RNA（guide RNA），就能实施特定基因位点的编辑。

1。2  CRISPR／Cas技术的优势

ZFN技术和 TALEN技术均是通过DNA引导的二聚体进行操作，每一个单体上都存在负责确定切割位置的DNA的结合机构域和负责对双链的DNA分子进行切割动作的非特异的DNA切割结构域。由于切割后形成断裂的DNA双链会激活内源非同源末端连接修复机制，导致随机的缺失和插入行为，从而导致基因读码框架的改变。该两项技术需要借助商业生产的试剂盒辅助完成实验，对实验难度和实验经费具有较大的考验[8]。

新一代的CRISPR技术同样能够对DNA序列进行编辑，起到破坏基因，或者插入外源序列的作用，并且实验成本远远低于前两项技术[8]。该技术只需一种单向RNA作为介导工具，以单体的形式发挥作用，只需要一个靶位点即可以完成对目标序列的切割动作[8]。目前发现并且应用于研究的CRISPR/Cas基因编辑系统分为三种不同的类型，即I型、II型和III型，它们均是存在于近40%已测序的真细菌和大部分的古细菌中。其中II型的系统组成较为简单，仅仅由Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)作为核心部分，是目前科学研究中最为深入的一种类型，而I型和III型CRISPR/Cas免疫系统则需要多个Cas 蛋白形成复合体切割双链DNA，II型CRISPR/Cas免疫系统仅需要一个Cas9蛋白来切割双链DNA，该系统是目前被改造最为成功的人工核酸酶[9]。其设计简单，实验制备过程简洁，实验高效，低廉的成本使这项技术一经问世之后立即取代了锌指核酸酶和其它一些基因组编辑技术。