大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析(7)
2.2.3.5 蛋白酶降解实验
取1 mL PBS重悬并且OD600调至1.0的相应菌液，加入5.2 U/mg灰色链霉菌蛋白酶使其终浓度为0.5 mg/mL，37 ºC温浴5 h。
2.2.3.6 细菌生长曲线的测定
将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD600值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。
3结果与分析
3.1 重组菌MB108的构建
3.1.1 大肠杆菌质粒pTrcHisC-inpN-gfp的提取结果
成功从含pTrcHisC-inpN-gfp的重组菌中抽提出质粒pTrcHisC-inpN-gfp。
电泳图谱如图1所示：
图1 pTrcHisC-inpN-gfp质粒提取电泳图
3.1.2 大肠杆菌质粒pTrcHisC-inpN-gfp的酶切验证
将提取的质粒pTrcHisC-inpN-gfp用NcoI/BglII双酶切。酶切结果电泳图谱如图2所示，双酶切后得到约4.9kb的pTrcHisC-gfp条带和约500bp的inpN条带，酶切片段大小与预期相符。
图2 pTrcHisC-inpN-gfp质粒酶切验证图
泳道M1：DL2000 泳道M2：λHindⅢ 泳道1：NcoI/BglII双酶切产物 泳道2：质粒
3.1.3 大肠杆菌质粒pTrcHisC-inpN-gfp的转化
将质粒 pTrcHisC-inpN-gfp转化大肠杆菌JM109，得到重组菌命名为MB108，涂布Amp抗性平板后得到的转化子结果如图3。
图3质粒 pTrcHisC-inpN-gfp转化大肠杆菌JM109得到的转化子
3.2 大肠杆菌细胞表面展示条件的优化
3.2.1 IPTG浓度对大肠杆菌表面展示效率的影响
将重组菌MB l08培养至对数生长中期(OD600值约为1)，在不同IPTG浓度下进行诱导表达。结果显示(图4)当IPTG浓度低于0.1 mM时，随着IPTG浓度的提高，全细胞GFP荧光强度也随之提高；当IPTG浓度高于0.1 mM时，GFP荧光强度趋于稳定。
全细胞荧光强度的测定不能完全反映出细胞表面展示效率的高低，因此将各IPTG浓度诱导后的重组菌MB l08进行蛋白酶处理，测定处理5 h后的全细胞荧光强度，结果如图5所示，经蛋白酶处理后，各IPTG诱导浓度下荧光强度有所下降。蛋白酶处理前的荧光强度与处理后的荧光强度的差值即为表面展示的GFP荧光强度。表面展示GFP的荧光强度所占的比例即为该诱导浓度下的表面展示效率。如图6所示，随着IPTG诱导浓度的增加，GFP荧光强度的减少值占初始荧光值的百分比减小，说明其展示在细胞表面的融合蛋白占细胞表达融合蛋白总量的百分比减少，即细胞表面展示效率降低。各浓度中以0.1 mM IPTG诱导后的展示效率最高(约38％)，IPTG浓度增至0.5 mM以上时，展示效率基本无变化(约25％)。未经诱导的重组菌MB l08虽有少量的渗漏表达，但细胞表面展示效率达到了92％，由于其本身初始荧光强度就小，所以后续实验选用IPTG的诱导浓度为0.1 mM。
图4 IPTG浓度与GFP荧光强度的关系
图中显示在不同IPTG浓度诱导下重组菌的绿色荧光强度值
图5 蛋白酶处理后细胞GFP荧光强度
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