乙草胺降解菌Sphingomonas sp.DC-6的发酵菌剂制备及应用(4)
1．2．6．2 海藻酸钠+氯化钙包埋法 称取海藻酸钠(SA) 0.2 g，放入烧杯，加入20 ml蒸馏水，沸水浴至完全溶解，后冷却至30℃左右，加入定量菌悬液和生物炭，混合均匀后，用针管将混合液滴至CaCl2溶液，形成固定化微球，4℃下交联4 h。然后用生理盐水冲洗固定化微球2-3次，置于30℃恒温鼓风干燥箱中烘干备用。之后，分别对海藻酸钠浓度(10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、CK)、菌体含量(0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、CK)、生物炭含量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、CK)和CaCl2溶液浓度(10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、CK)等影响因素进行条件优化。
1．2．6．3 壳聚糖微球包埋法 称量2.5 g壳聚糖溶于100 ml 1%的醋酸溶液中，室温静置过夜至完全溶解。将菌悬液和壳聚糖溶液混匀，用注射器将两者混合液逐滴加入到固化液0.25 mol/L的NaOH溶液中，使之成球，4℃交联4 h。用去离子水冲洗固定化微球表面2-3次，放置于30℃恒温鼓风干燥箱中烘干备用。
1．2．7 固定化微球保存 按1.2.6.2方法制备的海藻酸钠微球保存，现有4种方法，① 湿法保存(Wet)：放置于生理盐水环境中浸泡，4℃保存；② 真空保存(Vacuum)：放置于30℃恒温鼓风干燥箱中烘干后真空状态保存；③ 干燥保存(Dry)：放置于30℃恒温鼓风干燥箱中干燥，然后置于4℃环境中低温保存；④ 冷冻保存(Freeze-dry)：置于-20℃冷冻保存。放置1周，检测不同保存方法下固定化微球的乙草胺降解率以及重复利用率。
1．2．8 乙草胺水解酶的酶活测定 摇瓶接种后，培养12 h，加30 mg/kg乙草胺水溶液，诱导菌体产生乙草胺水解酶。继续培养12 h后，取样，12000 rpm、4℃离心10 min。取上清液用PBS缓冲液稀释至3 ml，加入30 mg/kg乙草胺溶液（甲醇溶），30℃水浴2 h，迅速取出，用等体积二氯甲烷萃取，终止反应。去除水相，保留有机相，加足量无水Na2SO4去除剩余水分。乙草胺用扫描型紫外-可见光分光光度仪200 nm-350 nm扫描时可在232 nm左右处出现最高峰，故可制作乙草胺含量的标准曲线，以此测量反应剩余的乙草胺含量，计算出酶活。
酶活计算公式：酶活(U/L)={[(乙草胺降解量×酶促反应体系体积)&pide;酶促反应时间(min)]&pide;(1 μmol×乙草胺的相对分子质量&pide;1 min)}&pide;添加酶液的体积(L)。
1．2．9 乙草胺含量标准曲线的制作 取7支干净的25 ml刻度试管，依次编号，分别添加标准乙草胺溶液配制的浓度分别为0、10、20、25、40、50、100 mg/kg的溶液。在232 nm波长下测定吸光度值。以乙草胺含量为横坐标，232 nm波长下吸光度值为纵坐标，经空白校正后绘制出标准曲线。
1．2．10 乙草胺降解效果检测 将固定化微球或菌悬液或生物炭悬液加到添加30 mg/kg乙草胺的100 ml基础盐培养基MM中，于30℃、180 rpm恒温摇床中振荡培养，并定时取样。采取紫外扫描法快捷定性测定降解液样品中的降解乙草胺残余含量。
紫外扫描法[11]：取样，加入等体积的二氯甲烷萃取，涡旋仪充分震荡2 min，然后静置至有机相和水相完全分层，然后吸取上层水相，保留有机相；上层水相再用等体积二氯甲烷萃取，两次得到的有机相经无水Na2SO4去除残留水分，于紫外-可见光分光光度仪上在波长200-350 nm范围内扫描；通过观察232 nm处特征吸收峰峰值的高低来判断样品中剩余乙草胺含量的高低，从而计算乙草胺降解率。
乙草胺降解率：ŋ=1－(乙草胺残余量/乙草胺初始量)×100%
1．2．11 乙草胺最大降解量测定 将按1.2.7.2方法制备的海藻酸钠微球分别加到50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg乙草胺水溶液中，放置于30℃、180 rpm恒温摇床中振荡培养，并定时取样。采取紫外扫描法快捷定性测定降解液样品中的降解乙草胺残余含量。