以上各母液的配置与N6大量的配置基本相同，配置时要根据所需的容积选择量筒，例如量取15ml的溶液，用20ml的量筒就比用50ml的量筒精确度高，虽然50ml的也可以量出15ml的，但是它的精准度不高，避免使用。各组分全都加到烧杯以后，若遇到比较难溶的，则需要再搅拌几分钟直到全都溶解，全都溶解以后，停止搅拌，加入蒸馏水到1L刻度线，继续搅拌，这时可以转速较小，以免溶液溢出等情况。

取一升的烧杯，用蒸馏水冲洗后往内加入600ml左右的蒸馏水，放置磁力搅拌器上，一开始转速可以调节较小，往里面加入N6大量50ml、B5微量10ml、RTV1ml、Fe盐10ml、葡萄糖10g、蔗糖20g、MES0。1g、MES0。5g、Dicamba2g、L-脯氨酸0。7g后，搅拌力度可适当加大，待全都溶解后，加蒸馏水到1L，用pH计调节pH到5。8左右，定容，称取4g琼脂倒入1L容量瓶内，再把配置好的溶液倒入容量瓶内，瓶盖不要拧紧，放到高压蒸汽灭菌锅内灭菌，灭菌后取出冷却到65摄氏度左右时就可以倒平板，在倒平板之前，加入AgNO3(17mg/ml)1ml、AS（0。1M）1ml、L-Cys(300mg/ml)1ml、DTT(150mg、ml)1ml,摇晃均匀，将培养皿包装袋表面用75%酒精消毒，再打开将培养皿放到无菌操作台上用紫外灯照射灭菌，二十分钟后就可倒平板，容量瓶在进入无菌操作台前也要用75%酒精消毒，依次倒平板，由于共培养阶段玉米幼胚很小，不需要包埋，只需要平铺在培养基上就可以，所以共培养阶段的培养基较薄，倒平板结束后，将风速调中档，加速培养基凝固。待到培养基都凝固结束后，将培养皿都至于4摄氏度冰箱内保存，培养皿的保存时间也不能太长，一般最多保存一个星期，时间过长会影响培养基的营养成分。

2。3 实验方法

2。3。1 实验预处理

在实验之前，将试验中会用到的手术刀、镊子等用具均放到75%酒精中消毒，或者放到高温灭菌器中灭菌，实验所用的玉米浸入75%酒精中消毒1分钟左右后取出，放在酒精灯旁边，全程酒精灯都需要打开。整个操作都需要在超净工作台上进行。

2。3。2 共培养阶段

将已经用75%酒精消毒后的玉米用手术刀削掉一半的胚乳后用手术刀尖将玉米幼胚挑出，置于已经配置好的共培养液中进行农杆菌侵染，侵染时间大概一分半后将幼胚取出，将幼胚盾片朝上地平铺到制备好的培养基中，幼胚之间需要有一定距离，平铺结束后，将培养皿盖放置酒精灯的火焰上灭菌几秒钟后盖上培养皿，右手拿着整个培养皿，将封口处对着酒精灯火焰灭菌后用封口膜封住。用签字笔在培养皿表面标记日期等信息。将培养皿置于已经调制好温度湿度等条件的恒温培养箱中培养。

2。4 单因素实验

本实验对培养基pH、共培养阶段的温度以及培养基中MES的加入量进行对比实验。

2。4。1 培养基pH文献综述

培养基的pH对幼胚的生长以及对培养基中的化学成分被幼胚的吸收是起着关键作用的。pH的改变会影响培养基中的培养基配置结束后，将所配置量分成五等分，分别调节pH到5。2、5。4、5。6、5。8、6。0五个梯度，经过高压灭菌后倒平板，每个平板用签字笔标注此培养基的pH。取大小基本相当的在1。5mm左右的幼胚，经过农杆菌浸染15分钟后取出平铺到五个梯度的不同培养基上，每个梯度做三个重复，每个培养基中放置30个幼胚，幼胚在培养基中需要相互之间有距离从而方便对培养基营养成分的吸收。幼胚平铺结束后，签字笔在培养皿表面标记培养基pH以及重复试验的序号等信息。放到恒温培养箱中培养两天后取出，对培养基中幼胚的生长以及对幼胚的GUS基因的表达进行比较，从而得出较适宜的pH[6]。