1.2.2  DNA 鉴定技术体系

随着社会的进步，形态特征鉴别法不再跟上时代的步伐，人们对于桑树品种 或者其他中药材的鉴定准确度要求越来越高，随之发展应运而生的是愈来愈成熟 的生物分子技术，目前已在研究领域运用到的技术方法有生物 DNA 鉴别法、色 谱分析法、光谱分析法等。与传统鉴别方法相比较，DNA 鉴定技术更科学，更 精准，它主要依据不同物种基因组间的某些 DNA 片段有差异性来进行物种鉴定[8]，这种方法不受自然条件或者人为因素的影响，即便外观差异较小的品种也能鉴定出来，鉴定结果更具有说服力，是品种鉴定技术尤其是在中药材方面的巨大 飞跃。

1.2.3 基于 DNA 序列分析的条形码技术

目前，在 DNA 鉴定技术体系中，应用和影响较为广泛的一类技术是基于 DNA 序列分析的条形码技术[9]。这类技术的运用依赖于庞大的生物信息数据库 和鉴定平台。其中生物信息数据库由各类生物基因组中的典型 DNA 序列片段组 成，这些 DNA 序列片段往往能够反映出生物种类的典型特征差异，长度相对较 短，称为 DNA 条形码。目前国际上已经有公认的标准的此类生物信息数据库建 成。利用 DNA 条形码技术时，只需要将待鉴定物种的 DNA 序列代表片段提取 出来，与数据库中已有的 DNA 条形码进行比对，从而完成物种的鉴别[10]。此类 技术由加拿大物种分类学家 PaulHebert 于 2003 年首次提出，因为分析速度快、 准确度高，受到国际学者的密切关注。

中国相关研究人员也关注到了这一点，并研究出在 DNA 条形码技术中发挥 主要作用的序列是 psbA-trnH 序列。但由于数据库中缺乏桑树或其他药用植物的 DNA 数据，使得目前此类技术在桑树和中药材鉴定方面的应用较少。我国学者 也正努力去充实植物类药材的 DNA 条形码数据库，比如陈世林等研究人员建立 了以 ITS2 为核心、psbA-trnH 为补充序列的植物类药材 DNA 条形码鉴定体系。 我们也相信随着生物技术的进一步提升，对于桑树品种鉴别方面的应用也会越来 越多。

1.2.4 基于 PCR 的分子鉴定技术

PCR 分子鉴定技术是一类利用简单的限定引物 PCR 对 DNA 模板进行扩增 的鉴定技术，它并不需要知道所研究对象的 DNA 信息。目前这种技术主要运用 在生物多样性和遗传关系分析方面。在中药鉴别方面有过相关的报道，如美国科 学家 PCShaw 等利用 RAPD 扩增技术[11]对人参、西洋参、三七及其混伪品进行 了鉴别研究。但是此种方法也有缺点，RAPD 标记技术仅仅通过引物进行简单的 限定扩增，稳定性和可重复性都不太可观，而且要进行实验和比较，对于一些品 种鉴别不适用。故该类方法不符合良好的鉴定要求。

1.2.5 色谱指纹图谱

(1)高效色谱鉴定技术 在中药材化学成分分离分析和鉴别应用上，色谱技术[14]是中药质量评价和控制的核心技术，其中薄层色谱最早应用于中药的理化鉴定，目前 HPLC 为代表的 高效色谱技术[15]逐渐成为中药鉴定主要技术，另外还有气相色谱法(GC)和高效 毛细管电泳(HPCE)等。在中药材鉴定上应用高效色谱鉴定技术源于“指纹图谱” 概念，也就是色谱技术对中药所含化合物进行分离和检测，然后得到表征各类成 分的系列色谱峰，通过色谱峰的数目、峰位和峰高度的不同特异性构建出特定化 学指纹图谱，该指纹图谱反映出研究对象的精细化学构成特征，可用于中药材品 种的鉴定。

理论上来讲，物种不同，色谱指纹也会不同，但环境对生物的代谢情况有着 较大的影响，同时这种技术本身也具有一定的局限性，而且在对样品进行前期处 理时对此种技术也会有影响，所以有时会造成即便是同一物种，药材的指纹图谱 也会有较大差别。因此，在运用基于“指纹图谱”的高效色谱鉴定技术对中药材 进行鉴别时，需要通过大量的样品数据来总结物种的共同特征。随着中药材品种 的不同，鉴定标准也会显示出差异，但这种差异都属于正常现象。HPLC 鉴定技 术是采用高压输液系统，以液体为流动相，在装有固定相的色谱柱里泵入极性不 同的流动相。这些流动相的成分在进入检测器进行检测前会在色谱柱里进行分离。 然后可将药材中的各类成分利用梯度洗脱技术进行分离，将结果显现在一张色谱图上。另外要说到的是，不同的色谱柱(固定相)、流动相和色谱系统对分离物的 分离效果有一定的影响，色谱指纹也会有某些差异。HPLC 色谱技术的优点在中药材鉴定方面的体现是具有很强的分离能力，能 够将中药材小分子化学成分的数和量方面的特征信息精准地测算出。HPLC 色谱 鉴定技术的缺点是色谱指纹的多变性，色谱指纹图谱提供的化学信息虽然比较精 细，但是不同中药材的鉴定特征提取和鉴定标准建立需要大量的样本；每种中药 的鉴定包括了特定的固相、流动相和检测方法的特定组合，所以鉴定方法上通用 性较差。随着色谱柱的品牌型号不同以及色谱仪器的影响，色谱指纹图谱也会稍 有变化。