对于黄素依赖性酶的催化模式，通过电子传递链，电子移动到最终电子受体，使偶氮染料被氧化还原而减少。例如来自大肠杆菌（AzoR）和来自粪肠球菌（AzoA）是乒乓Bi-Bi机制，来自NAD(P)H的电子通过FMN[7]转移到底物。AzoA具有两个单独的活性位点，FMN位于一个位点，另一个位点提供NAD(P)H和底物结合的空间。在通过AzoA还原甲基红的情况下，NADH首先将电子转移到FMN，然后作为NAD+，从酶中释放，之后，甲基红与酶结合，电子从FMNH2转移到甲基红。至于减少甲基红，需要两个循环的乒乓机制，如图1-1所示

图1-1偶氮还原酶作用机理（以甲基红为底物）[8]EFMN：黄素依赖性偶氮还原酶；EFMNH2：降低的黄素依赖性偶氮还原酶。Fig.1-1Mechanismofazoreductionbyazoreductase(MethyRedassubstrate)

EFMN:Flavindependentazoreductase;EFMNH2:reducedFlavindependentazoreductase

在黄素游离的偶氮还原酶中发现不同的机制。在通过来自P.kullaeK24（AzoB）的偶氮还原酶还原橙色I的情况下，AzoB在活性位点同时将两种底物（NADPH和橙色I）结合在一起，然后在AzoB的反应中心发生直接氢化物转移。这种机制需要复杂的结合模式，因此，这组偶氮还原酶显示窄的底物特异性，只有OrangeI可以被测试的偶氮染料中的AzoB降解[9]。另一方面，黄素依赖性偶氮还原酶家族具有广泛的底物特异性。来自粪肠球菌的AzoA可以降解甲基红，橙II，苋菜红，比布里希猩红，丽春红和甲萘醌[7]。

1.3热稳定性酶的概述

偶氮还原酶是偶氮染料降解菌表达的关键酶，在处理染料废水的生物修复方面具有独特优势[10]。尤其是具备热稳定性的偶氮还原酶，由于可用于高温环境且不易失活而具备较高的工业污水治理价值。

1.3.1热稳定性酶的结构特征

酶的热稳定性不能只归因于酶分子存在或合成修饰后有特定氨基酸作用的结果。热稳定性的酶是通过许多小结构的修饰获得的热稳定性，比如次级键（氢键、离子间相互作用中和疏水作用）的规范作用[11]。

1.3.2影响酶热稳定性的化学键

（1）氢键氢键是指极性基团共价结合的氢原子与另一基团上高电负性原子如氮原子（N）、氧原子（O）或氟原子（F）的孤对电子之间相互吸引而成的一种键。DVogt等人通过研究16种热稳定性不同的蛋白分子，有超过80%的蛋白分子的热稳定性与蛋白分子中氢键数量和其呈现正相关[12]。在RNaseT1的研究中，通过定点突变和结构比较证实，在酶分子内部形成一个氢键可使分子获得0.6kcal/mol净能量，氢键在蛋白质的稳定性上起重要作用[13]。

（2）疏水作用疏水作用是源于疏水物的疏水基团聚集所排斥开的水分子之间的相互作用。疏水作用是蛋白质蛋白热稳定性的主要作用力。JENKINS等人通过实验证明了蛋白分子的疏水作用与蛋白的热稳定性呈现正相关，即蛋白质分子的疏水作用越大，其热稳定性越显著[14]。PACE等人实验表明，对于蛋白质折叠过程中，每掩藏一个-CH2基团的稳定性获得1.3(±0.5)kcal/mol，此外，氨基酸侧链的疏水基对球状蛋白提供了良好疏水作用，从而增加了蛋白的稳定性[15]。

（3）离子键离子键是指带正负电荷离子或基团，因静电吸引而形成的键。酶分子的热稳定性与其氨基酸残基和残基或离子之间的相互作用有关。Alsop等通过比较127对同源的中温酶和嗜热酶，发现嗜热酶组表面明显有更多的酸碱对[16]。来自超嗜热生物的蛋白质维持生物学活性结构的温度明显高于同源常温，经研究发现超嗜热微生物耐热性这种区别主要是通过增加盐桥数量的静电相互作用[17]。

（4）二硫键（DisulfideBond）二硫键主要是通过降低蛋白解折叠状态的熵值来稳定蛋白结构[18]。利用突变技术在酶分子中引入二硫键可以充分证实二硫键的稳定效果。在枯草杆菌蛋白酶E通过定点突变引入Cys，枯草杆菌蛋白酶E半衰期比野生型延长了2-3倍[19]。