盐胁迫对两种油菜品种及其杂交后代的内源性硫化氢代谢和氧化损伤影响的初步(2)
油菜是中国五大油料作物之一，同时也是种植面积最高的油料作物，占全部国产植物油的40%以上[3]，因此保障油菜的产量是研究的热点之一。利用杂种优势可以有效保障油菜产量。杂交子代比两种亲本具有更好的性能的现象叫做杂种优势[4]，目前杂种优势的机制尚未研究清楚，主要有显性假说、超显性假说、基因差异表达假说等理论，但都尚未得到证实。杂交子代在抗胁迫能力上一般优于亲本，然而杂交后代很少具有遗传稳定性，其优良的性状只能文持一代。通过对杂种优势机制的研究可以为培育具有优良抗胁迫能力的具有遗传稳定性的品种提供理论基础。
硫化氢是普遍存在于生物体内的一种信号分子，是既一氧化碳、一氧化氮之后发现的最新的一种气体信号分子，于二十世纪末在动物体内被发现其信号分子功能[5]。在植物中硫化氢的研究起步相对较晚，因而研究结果较少，对于硫化氢在植物中的生理效应和机制的研究仍然是重要的研究方向。目前研究发现具有控制气孔开闭[6]、促进植物生长、增强植物抗胁迫能力等效应[7]。植物内源性硫化氢主要靠半胱氨酸水解半胱氨酸产生。
本文通过测定两种不同品种的油菜及其杂交后代叶片中脯氨酸、丙二醛、硫化氢含量以及L-半胱氨酸脱巯基酶活性来研究这些不同品种的抗盐胁迫的能力与硫化氢含量的关系。
2.材料与方法
2.1材料：
为了研究植物内源性硫化氢代谢与其所受的氧化胁迫的关系，本实验采用油菜品种CP3508, J4375 (Brassica campestris L., CP3508 and J4375)及其子代F1的幼苗作为实验材料，并使用蛭石和石英砂混合物盆钵栽培幼苗，并将幼苗置于温室中培养。
亲本分为盐胁迫实验组和空白对照组。空白对照组仅使用1/2 Hoagland培养液进行处理并在培养过程中灌溉1/2 Hoagland培养液。盐胁迫实验组首次处理使用含有100 mM NaCl的1/2 Hoagland培养液，并在培养过程中灌溉1/2 Hoagland培养液。
梯度实验组仅处理子代F1，首次处理使用含有100 mM，150 mM和200 mM NaCl的1/2 Hoagland培养液，并在培养过程中灌溉1/2 Hoagland培养液。空白对照组仅使用1/2 Hoagland培养液进行处理和灌溉。
2.2样本采集：
样本幼苗培养20天以上，采集前两天停止灌溉。采集长度5 cm以下的嫩叶200 mg（±10mg），包裹于铝箔中并放于液氮冻存。若需长期保存则存放于零下80摄氏度环境下。
2.3实验方法
2.3.1 脯氨酸测定
脯氨酸测定采用酸性茚三酮显色法[8-9]。在不含有氰化物的酸性条件下，1分子脯氨酸能够与2分子的茚三酮发生缩合反应生成红色物质，该红色物质在520 nm下有最大吸收峰[10]，通过测定520 nm下的吸光度可以测定脯氨酸的浓度。
在本次实验中，用3%磺基水杨酸溶液研磨0.2 g的冷冻植物叶片样品，离心后加入2 mL的25 mg/mL的酸性茚三酮溶液和2 mL冰醋酸溶液，沸水浴30分钟用甲苯萃取其中的红色物质，以空白甲苯为对照测量520 nm的吸光度。
2.3.2丙二醛测定
丙二醛测定采用硫代巴比妥酸法(TBARS) [10-12]。硫代巴比妥酸(TBA)能够与溶液中多种物质结合产生不同颜色的物质，例如糖类能与TBA产生最大吸收峰为450 nm的黄色物质，丙二醛(MDA)能够与TBA产生最大吸收峰为532 nm的红色物质。通过测定这两种波长的吸光度并相减，并代入标准曲线可以得到植物样品中的丙二醛含量。
取采集之后冷冻的样品0.2 g，用2 ml的10% 三氯乙酸溶液进行研磨，加入2 ml的0.67%硫代巴比妥酸溶液混合，沸水浴15分钟后12000 rpm冷却离心15分钟。
测定时取上清液，以去离子水为空白调零，测450 nm和532 nm的吸光度。