噬菌体协同生防细菌抑制番茄青枯病的效果研究(2)
近些年来，如今利用噬菌体进行细菌病害防治越来越受到人们的重视。与抗生素相比, 噬菌体具有特异性强、 副作用少、 增殖能力强且不易产生抗性等优点。但这些噬菌体的寄主范围狭窄，只能侵染一部分青枯菌。而青枯菌易变异，种内具有复杂的遗传多样性，只要细菌受体在噬菌体-细菌结合所需位点发生一个单一变化就能使细菌对噬菌体产生抵抗力，从而丧失疗效。而生防菌同样也存在着病原菌进化适应性的问题，导致防控效果降低。青枯菌能够快速进化对抗单一的生防细菌或噬菌体，但二者复配，从不同的方面攻击青枯菌，限制其抗性的进化。首先生防菌通过生态位竞争、营养竞争以及产生拮抗物质，形成第一道防线对抗病原菌，然后噬菌体侵染并裂解青枯菌，从而提高生防效果。这种假设理论上是可行的，但这种复配是否发挥作用，如何发挥作用以及作用机制尚不清楚，有待进一步研究。
2 材料与方法
2．1 供试菌株及培养
2．1．1 强致病力青枯菌QL-Rs1115 该菌分离自番茄根际【4】，其红色荧光蛋白标记菌株Rs-rfp为本研究的模式入侵病原菌。
2．1．2 生防菌解淀粉芽孢杆菌T-5 Bacillus amyloliquefaciens T-5分离筛选自青枯病田块中健康番茄根际，其绿色荧光蛋白标记菌株Rs-rfp为本研究的模式生防菌，其能产两种关键抗生物质（7-O-malonyl macrolactin A 和 Bacillaene）抑制青枯菌生长，具有很强的根际定殖以及显著降低病害发生的能力。
2．1．3 青枯菌特异性噬菌体PQL-14 噬菌体材料PQL-14由王孝芳博士生于2015年分离，供试菌株材料均保藏在本实验室-80 ℃冰箱。NA培养基用于生防细菌T-5和青枯菌常规培养，V8蔬菜汁和SMSA-E培养基分别用于生防菌T-5和青枯菌选择性培养基。
2．2 试验设计
共培养试验系统主要用于室内研究生防细菌和噬菌体单独和复合抵御青枯菌的能力，由以下 4 个环节组成：（1）培养基：该系统所用培养基是 NA培养基（2）接种微生物：即接种噬菌体、生防细菌T-5（绿色荧光标记菌株）或RS（红色荧光标记菌株）悬液（3）振荡培养：控温摇床，除特殊说明外，转速为 170 r/min，培养温度和时间根据实验需求设定（4）酶标仪检测：即在培养不同时期用酶标仪检测群落的 OD600 ，红色荧光强度（发射光：587 nm，吸收光：610 nm）和绿色荧光强度（发射光：485 nm，吸收光：533 nm）。
2．3 检测方法
将共培养过程中甘油保存的0、48、96 h的各处理的样品活化，各取100 µL加到900 µL的NA培养基中，25 ℃复苏30 min。然后取100 µL进行稀释，涂布SMSA青枯菌选择性培养基，30 ℃培养48 h，各处理随机挑取24个青枯菌的单菌落，加入到含200 µLNA培养基的96孔板中培养，30 ℃，170rpm，培养24 h后加入30%（v/v）甘油保存。青枯菌对生物环境胁迫的响应：
（1）噬菌体P0：将活化后的青枯菌与冷却至50 ℃的NA半固体培养基混合，铺在已凝固的NA培养基上，待吹干后，在平板上点接2 µL噬菌体悬液，30 ℃ 培养24 h，通过形成的噬菌斑的数量评价青枯菌对噬菌体侵染的抗性。
（2）生防菌T-5：将T-5培养48 h，离心过滤获得无菌的发酵液。活化进化前后的青枯菌作为种子液，利用微孔板系统，NA培养基，接种青枯菌，设置加（10%添加量）或不加T-5发酵液两个处理，测定12和24 h的OD600，评价进化前后青枯菌响应拮抗物质胁迫的能力。
利用育苗盘盆栽（田间）系统【5】，研究青枯菌在单一或双重胁迫处理下番茄根际的存活数量及侵染能力，评价进化后的青枯菌的致病性变化。Micro-Tom番茄种子经表面消毒后，在营养琼脂平板上进行无菌催芽，发芽的种子移植到9孔育苗盘中（装有灭菌基质或土壤）。待番茄植株长出3片真叶，按实验设计进行接种处理。考察各处理番茄植株的发病率，生物量、根际病原菌的数量。田间试验中，番茄苗（农户自选品种）进行接种处理后，移栽到田间塑料大棚，以此来检测进化前后青枯菌响应胁迫的能力【6】。
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