温度对根际细菌互作关系的影响研究(3)
而在另一方面，除了病原菌与其他微生物的互作之外，已有的研究表明温度也会影响植物的发病程度[35-37, 40]，并且适时地改变番茄幼苗的移栽时间，也会减少青枯病的发病率和发病概率[38, 39]。R. J. Bittner等人通过研究发现，温度对烟草的青枯病也有影响，其研究结果发现不同温度下青枯菌的茎部定殖率和植株的发病率都会发生一些变化[37] ；还有报道认为温度会改变植物根际的微生物活动，包括病原菌以及其他的有益的、有害的、中立的微生物[38]，这就为研究者提供了一个探究植物病害的新视角，即温度对植物根际菌之间的互作的影响。温度如何影响病原协同菌的生命活动？对拮抗菌的作用有什么影响？温度对植物的根际微生物区系又有什么影响？这些问题的解决将使我们对探索温度在植物病害中所起的作用有更深入的了解。
本研究旨在通过实验室室内培养体系在不同培养温度下用红色荧光蛋白标记的青枯菌（Ralstonia solanacearum， 以下简称“RS-RFP”）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens， 以下简称“T-5”）、叶杆菌（Phyllobacterium ifriqiyense，以下简称“HR69”）的共培养实验，以上述几种细菌的OD600值以及红色荧光值为基础数据，以抑菌率以及几种细菌稀释涂布计数的结果为考察指标，分析温度对三株菌的生长以及三株菌相互作用关系的影响，为更好的揭示青枯菌的生长机制打下了基础，也为开发温度防除青枯病的策略提供理论支撑。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株
表1-1 供试菌株
Table 1-1 Strains studied in this experiment
Strains Characteristics Source
HR69（Phyllobacterium ifriqiyense） Wild type Lab stock
T-5（Bacillus amyloliquefacien） Wild type Lab stock
RS-RFP(Ralstonia solanacerum) Plasmid with rfp marker gene, gen30r Lab stock
1．1．2 培养基和试剂
LB培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠5 g 、去离子水1000 mL，调节pH7.2-7.4，121摄氏度高压灭菌20 min。
NaCl 10 LB培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠10 g、去离子水1000 mL，调节pH 7.2-7.4，121摄氏度高压灭菌20 min。
改良NA培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、牛肉浸膏3 g、酵母膏0.5 g、去离子水1000 mL，调节pH 7.2-7.4，115摄氏度高压灭菌30 min。
青枯菌选择性培养基（SMSA）：在1000 mL 改良NA培养基中依次加入1% TTC 50 mg、结晶紫50 mg、多粘菌素100 mg、杆菌肽20 mg、氯霉素5 mg、放线菌酮50 mg、青霉素0.5 mg。
庆大霉素溶液（Gen 50）：用无菌水配制浓度为50 μM的庆大霉素溶液，抗生素粉末充分溶解后，在无菌操作的条件下过滤除菌。
配制固体培养基时按比例加入7%-9%的琼脂粉。
1．1．3 仪器设备
酶标仪（SpectraMax M5 Plate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA），摇床（知楚仪器，ZQWY-200），小型高速离心机（Eppendorf 5424），48孔、96孔细胞培养板，φ90 mm塑料平板
1．2 叶杆菌HR69和解淀粉芽孢杆菌T-5对青枯菌RS-RFP的作用效果测定
1．2．1 菌种活化
从-80 ℃保存的菌种甘油管中用接种环小心取出菌种，青枯菌RS-RFP在改良 NA 平板上划线培养，叶杆菌HR69和解淀粉芽孢杆菌T-5在LB平板上划线培养，至平板上形成肉眼可见的单菌落。活化过程保持严格的无菌操作。
1．2．2 试管培养
分别从各平板上挑取单菌落，接入3 mL的改良NA液体培养基中，放在摇床中培养过夜，摇床内环境温度设置为30 ℃，转速170 r/min。其中青枯菌RS-RFP的改良NA液体培养基中要接入终浓度为30 μg/mL的庆大霉素。转接菌体和接入抗生素的过程保持严格的无菌操作。