怀牛膝多糖提取及抗氧化活性(2)
1.实验部分
1.1 实验所用材料、仪器及试剂
材料：怀牛膝，购买于周口市同和堂药店。
试剂：氯仿、正丁醇、乙醚、苯酚、浓硫酸、双氧水、丙酮、乙醇、盐酸、甲醇等均为分析纯。
主要仪器：S22pc可见分光光度计(上海凌光技术有限公司）；恒温水浴锅HH-S6（巩义市矛华仪器有限责任公司）；海尔冰箱BCD-215KCM（青岛海尔股份有限公司）；恒温振荡器LRH（上海一恒科学仪器有限公司）；系列生化培养箱THZ -98AB（昆山一恒仪器有限公司）；电子天平AL204（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；HC-3018高速离心机（安徽中科中佳科学有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科技术有限公司）；SYQ-DSX-280B不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海恒科技术有限公司）；SW-CJ-2FD型洁净操作台（苏州安泰空气技术有限公司）；SHB-III循环水式真空泵（郑州欧卡仪器设备有限公司)；微波炉（海尔集团有限公司）。
1.2 怀牛膝多糖的提取及含量测定
多糖含量的测定采用苯酚硫酸法[6-7]，以葡萄糖为标准品，蒸馏水作为提取剂。苯酚硫酸法的原理是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。
1.2.1 葡萄糖标准溶液的配制
准确的称取0.1g葡萄糖并用蒸馏水溶解定容至1000 mL，配制成100 μg/mL的标准溶液。
1.2.2 标准曲线的绘制
准确的分别移取标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 mL浓度为100 μg/mL的葡萄糖溶液，置于各个试管中，全部加蒸馏水补足至每试管1 mL，然后各加入1 mL 的6%的苯酚溶液，摇均匀，再依次加入5 mL 的98%浓硫酸，摇均匀，都要经过15 min的静止，置于温度为40℃的条件下30 min，取出冷却，于波长490 nm处测定吸光度D490 nm，结果如表1、图1。将待测试管中葡萄糖的浓度与吸光度作回归处理，得到回归方程y=0.0073x－0.0188。
表1 葡萄糖浓度与吸光度的关系
葡萄糖浓度
C（μg/mL） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
吸光度A 0 0.036 0.147 0.165 0.286 0.341 0.404 0.491 0.566 0.641
图1 葡萄糖标准曲线
1.2.3 怀牛膝多糖提取的工艺流程[8]
微波辅助提取法：干燥的怀牛膝→剪碎称取40 g→加入1:20的蒸馏水→在80℃温度下水浴浸泡2 h→微波提取一次→抽滤→微波提取一次→抽滤→合并提取液→按照5:1的比例在合并液中加入氯仿、正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=5:1）后充分摇匀（目的除去蛋白质）→离心（3000 r/min，10 min），取上清→烘箱浓缩→按照浓缩液与乙醇比为1:3的比例加入无水乙醇（使多糖沉淀）→搅拌均匀、静置过夜→离心（3000 r/min，15 min），取沉淀→用乙醚洗涤沉淀→牛膝多糖粗提物→加蒸馏水定融到50 mL容量瓶。
热水浸取法：怀牛膝与蒸馏水1:20，浸提在水的温度为80℃里，提前浸泡24 h（不需要微波），再抽滤，按上述步骤重复一次。其他热水浸提步骤与微波辅助提取完全一样。
1.2.4 怀牛膝多糖提取率的测定[9-11]
从不同提取方法的粗提取液中各取出1 mL，定容于1000 mL的容量瓶里。摇匀，再各取出1 mL置于10 mL的试管中，各加入6%的苯酚溶液1 mL，摇匀，依次加入98%的浓硫酸5 mL，摇匀，静止15 min后，置于40℃的条件下30 min，冷却，于波长490 nm处测定吸光度。根据回归方程算出测量多糖的C（μg/mL），按照以下公式计算提取物多糖的提取率（mg/g）。
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