多糖的提取率(mg/g)=CVK×10-3/W
式中:C-测量液多糖的浓度(µg/mL);V-粗糖提取液的体积(mL);K-粗糖提取液稀释的倍数;W-原料的干重(g)。
1.3 怀牛膝多糖提取液的抗氧化活性
1.3.1 怀牛膝多糖对超氧阴离子自由基(O2-•)清除活性
邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化,释放出超氧阴离子,生成的中间产物在紫外区有吸收。经波长扫描,在320 nm处有最大吸收。经时间扫描,该反应在4 min后趋于平缓[12]。
取两只具塞试管,各加入0.05 mol/L pH 为8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL,于25℃水浴中恒温20 min,分别加入样品液2 mL和25 mmol/L的邻苯三酚溶液0.5 mL,混匀后于25℃水浴中反应5 min,加入6 mol/L HCl 1 mL终止反应,在320 nm 处测定吸光度A1,空白对照组以试样溶剂代替样品,吸光值A0。考虑样品液本身可能在320 nm处有吸收,用相同体积的样品液代替邻苯三酚,吸光值A2。每个处理均做3个重复。
超氧阴离子自由基清除率= [(A0-(A1-A2) ]/A0 ×100 % [13]
式(1)中:A1为试样的平均吸光度;A0为空白的平均吸光度。
1.3.2 怀牛膝多糖对羟自由基(•OH)清除作用[14-16]
取三支10 mL试管,各加0.2 mL 的7.5 mmol/L硫酸亚铁铵溶液、0.2 mL的7.5 mmol/L 邻二氮菲(邻菲罗啉)溶液、1.0 mL的 pH=7.4 Tris-HC1缓冲溶液,在后两支试管中,分别加入1.0 mL的 7.5 mmol/L H2O2,在三号试管中加适量样品津提液,加蒸馏水定容至10 mL,在37℃水浴锅中反应1 h,冷水冷却,以蒸馏水为对照,于508 nm波长处测定其吸光度,每个处理均做3个重复。计算清除率:
羟自由基清除率=(A样品—A损)∕(A未损—A损)×100%[17]           
A样品、A未损、A损分别为加入提取液的羟自由基体系、不加H2O2及加入H2O2体系的吸光度。
2.结果与分析
2.1 不同提取方法对怀牛膝多糖提取率的影响
实验采用微波辅助提取和热水浸提法提取怀牛膝中的多糖,并以苯酚硫酸法测定多糖的含量。
 
图2 不同提取方法对怀牛膝多糖的提取率
由实验结果图2可知,微波辅助提取法对怀牛膝多糖的提取率较高为74.81 mg/g,热水浸提法的提取率是70.87 mg/g。由于热水浸提的缺点是提取温度高,耗时长且效率低,成本高,安全性低。而微波辅助法的热效率高,温度升高快速而均匀,且微波的频率很高,能深入渗透物体,对细胞的结构有较大作用。因此,应用微波辅助提取手段,能够显著缩短提取时间,较大程度地提高多糖的提取效率[18-19]。
2.2 怀牛膝多糖提取液的抗氧化活性
本研究采用分光光度法测定怀牛膝多糖提取液的抗自由基活性,其抗氧化活性结果如图3、4。
 
图3 怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子自由基的清除率
 
图4 怀牛膝多糖提取液对羟自由基的清除率
由实验结果图3、4可知:微波辅助提取液对超氧阴离子自由基的清除率为70.48%,对羟自由基的清除率为45.54%。热水浸提液对超氧阴离子自由基的清除率为68.34%,对羟自由基的清除率为40.44%。
由上述数据可知多糖提取物均有较强的抗氧化活性,其中微波辅助提取的抗羟基自由基和抗超氧自由基较强。在实验浓度范围内,怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子和羟自由基均有明显的清除效果。其原因可能是多糖分子上具有还原性的半醛酸羟基,可与活性氧发生氧化还原反应[20]所致。
3.结论
本实验采用微波辅助提取(料液比1:20,浸提温度80℃,提前浸泡2 h,微波功率中高火,微波1 min)和热水浸提(料液比1:20,浸提温度80℃,浸泡24 h)两种方法,提取怀牛膝中的多糖,并采用苯酚硫酸法测定多糖的含量。同时,测定怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子自由基(O2-•)和羟自由基(•OH)的清除率。由实验结果可知,微波辅助法对怀牛膝多糖的提取率为74.81 mg/g,高于热水浸提法的提取率70.87 mg/g。且怀牛膝多糖提取液具有较好的抗氧化活性,对各种形式的活性氧均有明显的清除作用。微波辅助提取液对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别为70.48%、45.54%。热水浸提液对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别为68.34%、40.44%。
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