大豆离体叶片对斜纹夜蛾抗选性鉴定方法完善及应用(2)
通过研究大豆对墨西哥豆甲(Epilachna varivestis Mulsant)的抗性，筛选出抗源PI171451、PI227687和PI22935，这三份抗源经过后人验证发现具有对黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)和玉米穗螟(Helicoverpa zea Boddie)等多种食叶性害虫的广谱抗性[6,7]。随着大豆抗虫资源筛选研究的发展，大量的地方品种和育成品种被广泛收集用于抗虫性评价和资源遴选[8-11]。
抗虫鉴定方法是抗虫育种的基础。大豆对斜纹夜蛾的抗性机制主要包括抗选性和抗生性，其中抗选性鉴定方法包括：田间自然虫源法、网室人工接虫法和离体叶片抗选性鉴定方法[9-10, 12]，而抗生性鉴定方法以室内生物测定为主[13]。抗选性鉴定指标主要包括：叶面积损失率[8]和幼虫密度[14]，抗生性鉴定指标一般以幼虫重、蛹重、发育历期等为抗性鉴定指标[11, 15]。田间自然虫源法以叶面积损失率为鉴定指标，但是易受斜纹夜蛾自然种群发生量的影响和受到其它食叶性害虫及天敌的干扰。虽然网室人工接虫法能减少生物因素带来的误差，但是非生物因素（高温、暴雨和台风等灾害天气）仍然会影响试验。通过利用培养皿（口径为9cm）作为鉴定场所，以打孔成方形叶片作为鉴定样本，人工接虫危害14小时后，调查处理和对照样本的抗性差异，实现在室内进行快速且可靠的抗选性鉴定[12]，该方法具有简单和周期短等特点。本研究旨在完善大豆离体叶片对斜纹夜蛾抗选性的鉴定方法，并对大豆抗虫代表性样本群体进行抗选性评价，筛选出高抗和高感品种；同时对该群体进行关联分析，挖掘出抗选性主效位点。
1 材料与方法
1 材料与方法
1.1试验材料
通过田间自然虫源鉴定方法，从国内外6724份大豆种质资源中筛选出45份抗虫和感虫材料[9]；在以上材料基础上加入6份江淮及南方地区推广良种共51份，在网室进行斜纹夜蛾抗选性鉴定[10]；又加入6份高产的育成品系共57份在室内进行抗生性鉴定[11]。随着大豆抗虫资源研究的扩展，又加入19份优异材料，其中包括国际抗虫种质Lamar[16]以及抗和感虫杂交组合的亲本，共计76份组成大豆抗、感虫代表性样本群体（简称：IRSGP）。
1.2叶片来源
供试叶片来自南京农业大学江浦试验站的大田。2016年6月夏播，供试材料均采用单行种植，行长2m，行距0.5m，试验区周围各设置两行保护行，大豆生长期间不喷洒任何杀虫剂。当大多数材料处于R1期[17]，利用剪刀和自封袋采摘新鲜叶片，并用冰盒保存，供培养皿法抗选性鉴定试验。
1.3斜纹夜蛾幼虫的人工繁殖
试验所用的斜纹夜蛾幼虫由南京农业大学植物保护学院昆虫系提供，初始虫源经人工饲养、扩繁，获得大量三龄幼虫作为供试虫源。
斜纹夜蛾的人工饲养参照朱丽梅[18]的方法。斜纹夜蛾饲养于标准养虫室中，养虫室面积约为5m2左右，室内温度控制在26±1℃，相对湿度60-70%，光暗比为14:10，养虫室每个世代杀菌消毒一次。
1.4设备和流程
离体叶片抗选性鉴定工具主要包括：15cm口径培养皿、定性滤纸、自制底面边长为2.5cm的正方形打孔器。供试虫源是三龄初期的斜纹夜蛾幼虫，鉴定场所为标准养虫室（温度26±1℃，相对湿度60-70%，光暗比为14:10），接虫时间选在养虫室进入黑暗时段的前期（减少叶片的水分蒸发）。
田间采集叶片装入自封袋，再将自封袋放入冰盒中保鲜。定性滤纸铺满培养皿底部并加水润湿以保证叶片新鲜，将培养皿一端做上标记，并分别放入三组对照和处理的方形叶片，每个培养皿中心接大小相对一致的三龄幼虫三头；将接虫后的培养皿放入到标准养虫室，分别在接虫14小时和18调查处理和对照组的叶面积损失率。叶面积损失率以5%为基准递增，最小值是0，代表方形叶片完整，最高值是100%，代表方形叶片被完全取食。